碱性磷酸酶.doc

碱性磷酸的提取分离纯化及其性质的研究李小旭,赵彦彦,周晓倩,张林顺,伍红,林亚秋摘要:从新鲜兔肝中提取碱性磷酸酶,进行分离纯化得到纯度较好的碱性磷酸酶,然后测定其 km ,对最适温度及其热稳定性、最适 pH 及酸碱温度性的研究, 最后用 KH2PO4 进行抑制剂类型鉴别。关键词:温度、 pH 、酶、 Km 、抑制剂前言:酶是具有生物催化功能的大分子,在一定的条件下,酶可催化各种生化反应。酶的催化作用具有催化效率高,专一性强和作用条件温和等显著特点,所以酶在医药、食品、轻工、化工、环保、能源和生物工程等领域应用广泛。应用之前要先对酶的性质等进行研究,进行酶活力测定,研究抑制剂对酶活性的影响等等。在抑制剂的的作用下,酶的催化活性降低甚至丧失,从而影响酶的催化功能。抑制剂有可逆抑制剂和不可逆抑制剂之分。不可逆抑制剂与酶分子结合后, 抑制剂难以除去,酶活性不能恢复。可逆抑制剂与酶的结合是可逆的,只要将抑制剂除去,酶活性即可恢复。根据可逆抑制剂作用的机制不同,酶的可逆抑制作用可以分为竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制三种。酶活力测定的方法多种多样,有化学测定法、光学测定法、气体测定法等。对酶活力测定的要求是快速、简便、准确。酶活力测定通常包括连个阶段,首先在一定条件下,酶与底物反应一段时间,然后再测定反应液中底物或产物的变化量。而酶的活力高低, 是以酶的单位数来表示的。 1961 年国际生物化学与分子生物学联合会规定,在特定条件下(温度可采用 25℃, PH 等条件均采用最适条件) ,每 1min 催化 的底物转化为产物的酶量定义为一个酶活力单位,这个称为国际单位。由于这个规定没有法律效力所以在现实使用的酶活力单位多种多样。国际上另一个常用的酶活力单位是卡特( kat ) 。在特定条件下,每秒催化 1mol 底物转化为产物的酶量定义为 1卡特( kat )。 1 材料与方法 材料 碱性磷酸酶的分离纯化实验本实验使用的原料是新鲜兔肝,仪器有:离心机、搏力匀浆器等,试剂有: ( 1) 醋酸镁溶液( 醋酸镁溶于蒸馏水中,定容至 1000ml )、( 2) 醋酸钠溶液( 醋酸钠溶于蒸馏水中,定容至 1000ml )、( 3) / L 醋酸镁- 醋酸钠溶液(准确吸取 20ml 醋酸镁溶液及 100ml 醋酸钠溶液,混匀后定容至 1000ml 、( 4) Tris-HCl 缓冲液(称取三羟***甲烷 , 用蒸馏水溶解后定容至 1000ml ,即为 Trls 溶液。取 s溶液, 加蒸馏水约 780ml ,再加 / L 醋酸镁溶液 100ml , 混匀后用 1% 冰醋酸调 pH 为 ,用蒸馏水定容至 1000ml )、( 5)正丁醇、***、 95% 乙醇。 碱性磷酸酶的动力学鉴定—— Km 测定本实验用的仪器有:水浴锅、 721 型分光光度计;试剂有:( 1) 作用液(称取 磷酸苯二钠 , 用煮沸后冷却的蒸馏水溶解, 并稀释至 1000ml