作物青枯病LAMP检测技术规程（征求意见稿）.doc

ICS点击此处添加中国标准文献分类号DB江西省地方标准DB36/XXXXX—XXXX作物青枯病LAMP检测技术规程TechniquelyRulesforLAMPDetectiononTuberCropsBacterialWilt[Ralstoniasolanacearum(Smith)]点击此处添加与国际标准一致性程度的标识XXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施江西省市场监督管理局发布目次前言 II1 1术语和定义 12 样品采集 13 样品处理 24 LAMP反应 25 LAMP检测结果判断 2附录A(资料性附录) LAMP检测引物、5×LAMP混合引物配制及反应体系和条件 3前言本标准按照GB/-2009给出的规则起草。本标准由江西省农业农村厅提出并归口。本标准起草单位:江西省农业科学院植物保护研究所、江西生物科技职业学院、江西省植保植检站。本标准主要起草人:李信申、曾荣、华菊玲、黄小梅、陈建、黄瑞荣、黄建华、王希。作物青枯病LAMP检测技术规程范围本标准规定了马铃薯、甘薯、芝麻、花生、烟草及茄科蔬菜等作物青枯病(bacterialwilt)的LAMP检测技术。本标准适用于马铃薯、甘薯、芝麻、花生、烟草及茄科蔬菜等作物青枯病LAMP检测。术语和定义下列术语和定义适用于本标准。LAMP扩增技术Loop-mediatedisothermalamplification环介导等温扩增技术(简称LAMP扩增技术)是一种可于特定恒温条件下,实现短时间内对靶标序列高效扩增的技术。检测结果通过肉眼观察绿色荧光的生成进行判断。该技术具有“简便、快速、精确、低价”的特点。已广泛用于病害的诊断及病原菌的定性定量检测。引物primer指一小段单链DNA或RNA,作为DNA复制的起始点,在核酸合成反应时,作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链。反应体系LAMP反应体系主要要素为:外引物、内引物、dNTP、、10×ThermoPolbuffer缓冲液、MgSO4、Mncl2、甜菜碱、模板和钙黄绿素。在恒温条件下,;而反应体系中的染料与Mn2+结合发生颜色变化,达到可视化目的。样品采集将新鲜的疑似病株用吸水纸包好,整株带回实验室,保存于4℃冰箱,备用。样品处理截取适量待检测样品,悬浮于装有适量无菌水的试管中并剪碎,静置30min;或加适量无菌水研磨,静置5min,取上清液。以悬浮液或上清液为模板,以无菌水为空白对照,进行LAMP检测。LAMP反应以提取的疑似作物病株样品组织悬浮液或上清液为模板,以模式菌株GMI1000菌悬液为阳性模板,以无菌水为阴性模板,采用特异性引物(附件A)对待测样品进行LAMP检测。扩增反应在25μL体系中进行,各组分如下:×ThermoPolbuffer[20mMTris-HCl(),10mMKCl,10mM(NH4)2SO4,2mMMgSO4,%TritonX-100),,,5µL5×LAMP引物混合物(附件A),1µL样本悬浮液或上清液,(8000U/mL),4μL5M甜菜碱,1µ,1µ