TUNELroche使用流程.doc

Insitucelldeathdetectionkit-POD法一、原理:TUNEL(TdT-mediateddUTPnickendlabeling)细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。其原理是脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdTEnzyme)把荧光素(fluorescein)标记的dUTP(三磷酸脱氧尿甘)连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端,并与连接辣根过氧化酶(HRP,horse-radishperoxidase)的荧光素抗体特异性结合,HRP又与HRP底物二氨基联苯***(DAB)反应产生很强的颜色反应(呈深棕色),特异准确地定位正在凋亡的细胞,因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞;由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂,因而没有3‘-OH形成,很少能够被染色。本试剂盒适用于组织样本(石蜡包埋、冰冻和超薄切片)和细胞样本(细胞涂片)在单细胞水平上的凋亡原位检测。还可应用于抗肿瘤药的药效评价,以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。二、器材与试剂器材:光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒(塑料饭盒与纱布)、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等;试剂:试剂盒含TdT10×、荧光素标记的dUTP1×、标记荧光素抗体的HRP;自备试剂:PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇(100、95、90、80、70%)、DAB工作液(临用前配制,5μl20×DAB+1μL30%H2O2+94μlPBS)、ProteinaseK工作液(10-20μg/mlin10mMTris/HCl,-8)或细胞通透液(%TritonX-%sodiumcitrate,临用前配制)、苏木素或***绿、DNase1(3000U/ml–3U/mlin50mMTris-HCl,,10mMMgCl2,1mg/mlBSA)等。三、实验步骤操作流程图:制作石蜡切片→脱蜡、水合→细胞通透→加TUNEL反应液→加converter-POD→与底物DAB反应显色→光学显微镜计数并拍照。具体操作步骤(石蜡包埋切片的检测):,每次5min;(100、95、90、80、70%)各浸洗1次,每次3min;注:-30min在21–37°C(温度、时间、浓度均需摸索)或者加细胞通透液8min;;,处理组用50μlTdT+450μl荧光素标记的dUTP液混匀;而阴性对照组仅加50μl荧光素标记的dUTP液,阳性对照组先加入100μlDNase1,反应在15~25℃×10min,后面步骤同处理组。,加50μlTUNEL反应混合液(阴性对照组仅加50μl荧光素标记的dUTP液)于标本上,加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×1h。;(激发光波长为450~500nm,检测波长为515~565nm);-POD于标本上,加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×30min。;~100μlDAB底物,反应15~25℃×10min;;***绿复染,几秒后立即用自来水冲洗。梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。,用光学显微镜观察凋亡细胞(共计200~500个细胞)并拍照。可结合凋亡细胞形态特征来综合判断(未染色细胞变小,胞膜完整但出现发泡现象,晚期出现凋亡小体,贴壁细胞出现邹缩、变圆、脱落;而染色细胞呈现染色质浓缩、边缘化,核膜裂解,染色质分割成块状/凋亡小体)对于培养细胞的预处理:①在载玻片上铺一层薄薄的多聚赖氨酸(见备注4),干燥后在去离子水中漂洗,干燥后4℃保存;②适当方法诱导细胞凋亡,同时设未经诱导的对照组,各组离心收集约1×106个细胞,PBS洗一次,重悬,加到铺好的多聚赖氨酸载玻片上,自然干燥,使细胞很好的吸附到载玻片上;③将吸附细胞的载玻片在4%多聚甲醛(见备注2)中固定25min;④PBS浸洗二次,每次5min;⑤%的TritonX-100(见备注5)中处理5min;⑥PBS浸洗二次,每次5min;后续操作如同石蜡包埋切片的6—15四、,每次清洗5min。,为了各种反应的有效进行,请尽量除去PBS溶液后再进行下一步反应。,请盖上盖玻片或保鲜膜,或在湿盒中进行,这样可以使反应液均匀分布于样本整体,又可以防止