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标准的 PCR反应体系
PCR反应体系与反应条件
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标准的

PCR反应体系：
10×扩增缓冲液

10ul
4 种

dNTP混合物

各 200umolL
引物

各 10～ 100mol
模板

DNA

01～2ug
TqDNA聚合酶 25u
g2+ 15mmolL
加双或三蒸水至 100ul
PCR反应五要素：参加 PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、 dNTP、模板和 g2+
引物：引物是 PCR特异性反应的关键， PCR产物的特异性取决于引物与模板 DNA互补的程度。 理论上， 只要知道任何一段模板 DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引
物，利用 PCR就可将模板 DNA在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则：
①引物长度：

15-30b ，常用为

20b 左右。
②引物扩增跨度：以

200-500b

为宜，特定条件下可扩增长至

10kb

的片段。
③引物碱基： G+C含量以 40-60%为宜， G+C太少扩增效果不佳， G+C过多易出现非特异条带。 ATGC最好随机分布，避免 5 个以上的嘌呤或嘧啶 核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是

3'

端的互补，否则会形
成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物 3' 端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致 PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性： 引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。 引物量： 每条引物的浓度 01～ 1umol 或 10～100mol ，以最低引物 量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
酶及其浓度 目前有两种 TqDNA聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然
酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的 PCR反应约需酶量 2。 5U( 指总反应
体积为 100ul 时 ) ，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
dNTP的质量与浓度 dNTP的质量与浓度和 PCR扩增效率有密切关系， dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。 dNTP 溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以
1NH或 1Tris 。 HCL的缓冲液将其 PH调节到 70～75，小量分装， - 20℃冰冻保存。多次冻融会使 dNTP降解。在 PCR反应中， dNTP应为 50～ 200umolL ，尤其是注意 4 种 dNTP的浓度要
相等 ( 等摩尔配制 ) ，如其中任何一种浓度不同于其它几种时 ( 偏高或偏低 ) ，就会引起错配。
浓度过低又会降低 PCR产物的产量。 dNTP能与 g2+结合，使游离的 g2+浓度降低。
模板 ( 靶基因 ) 核酸 模板核酸的量与纯化程度，是 PCR成败与否的关键环节之一，传统的 DNA纯化方法通常采用 SDS和蛋白酶 K 来消化处理标本。 SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白， SDS还能与蛋白质
结合而沉淀； 蛋白酶 K 能水解消化蛋白质， 特别是与 DNA结合的组蛋白， 再用有机溶剂
酚与***仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份， 用乙醇或异丙醇沉淀核酸。 提取的核酸即可作为模板用于 PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化
除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于 PCR扩增。 RNA模板提取一般采用异硫***酸胍或蛋白酶 K 法，
要防止 RNse降解 RNA。
g2+浓度 g2+对 PCR扩增的特异性和产量有显著的影响， 在一般的 PCR反应中， 各
dNTP浓度为 200umolL 时，g2+浓度为 15～ 20m