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d-对羟基苯甘氨酸氨基转移酶基因表达和活性的研究.pdf


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独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果,除了文中特别加以标注和致谢之处外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得天津大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名: 签字日期: 年月日我是爱天大的!! 学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津大学有关保留、使用学位论文的规定。特授权天津大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。(保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名: 导师签名: 签字日期: 年月日签字日期: 年月日摘要苯甘氨酸氨基转移酶( 4-Hydroxyphenylglycine aminotransferase )是假单胞菌所产生的一种能够合成 D-苯甘氨酸的重要转氨酶。目前国内对于该酶的研究较少,因此对于该重组酶体外活性的测定,研究其主要功能和酶动力学,对于该酶在工业上的应用有重要的意义。依据密码子偏好性,设计、优化、合成 hpgt 全长基因,并成功构建了大肠杆菌- 毕赤酵母穿梭载体 pPIC9K- hpgt ,并将其整合至毕赤酵母 GS115 的染色体中,以期实现其分泌表达。对整合有 hpgt 基因的毕赤酵母进行摇瓶发酵实验, 获得了重组酶,并测定转化率及其酶的活性。构建原核重组质粒 pCDF- hpgt ,并将其转入感受态细胞 BL21 ( DE3 ), 通过优化表达条件获得可溶性的重组蛋白 His-HpgT 。利用 Ni-NTA 柱纯化技术获得高纯度的 His-HpgT 融合蛋白,蛋白浓度为 mg/mL 。分别测定融合蛋白在正反向反应中的酶活力单位及最佳的反应温度、 pH 值及其他动力学参数,并对该酶特性作相关的机理分析。测定结果表明,正向反应和反向反应的酶比活力分别为 749 mU/mg 、2257 mU/mg ,此酶分解苯甘氨酸的能力要强于合成苯甘氨酸;正向反应的最适温度与 pH 分别是 35 ℃和 ;由米氏方程得出该酶对苯甘氨酸的亲和力远大于谷氨酸;较低浓度的苯乙醛酸即可抑制反应的进行。在研究了恶臭芽孢杆菌中 hpgt 的优化表达、酶动力学特性的基础之上,对该酶进行了蛋白结构分析与小规模的突变工作探索。为该酶在工业中的应用提供一定的理论基础。关键词: D- 苯甘氨酸, HpgT ,密码子优化,酶动力学,随机突变 ABSTRACT 4-Hydroxyphenylglycine aminotransferase which can synthesize D-phenylglycine transaminase is produced by Pseudomonas. Domestic HpgT research has few studies , so the catalytic activity of this enzyme in vitro, the catalytic function and the enzyme ics of HpgT which measured in this paper, are very important to the applications of the enzyme in industry. First, the hpgt gene was synthesized through the codon optimization technology and the shuttle vector pPIC9K- hpgt of and P. pastoris was constructed. After that, the shuttle vector pPIC9K- hpgt was integrated into the P. pastoris GS115’s chromosome so as to realize secretory expression. HpgT was produced from binant strains fermented in the shaking flask and meadured. Then the binant prokaryotic plasmid pCDF- hpgt was obtained. The plasmid was transformed

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  • 时间2016-04-22
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