水稻原生质体制备及转化方法.doc

原生质体制备及转化
%的酒精中消毒1 min。%的次***酸钠消毒20 min。用无菌水洗至少5次，然后在1/2 MS培养基上，12 h光照（大约150umol m-1 s-1）十二小时黑暗，26 ℃培养7-10天，提前一天烧好去尖的黄蓝枪头备用。
-60棵水稻幼苗的茎和叶鞘的绿色组织。
（大概10棵幼苗） mm的小段。
M的甘露醇中，黑暗中放置10 min。
，将小片段放在加入15mL酶液的25mL锥形瓶中，（% Cellulase RS，% Macerozyme R-10， M甘露醇， MES，10mM CaCl2，% BSA），28℃摇床中轻轻摇晃（50rpm），黑暗孵育4-6 h。
%的PEG4000，酶消化后，分三次加入等体积15mL的W5溶液（154 mM NaCl，125mM CaCl2,5 mM KCl，pH MES）。用手充分摇晃10s。
。
（升降速度设为1档）5min，缓慢吸走上清液。
W5溶液，轻轻悬浮，再离心80g，5min，弃上清
Mmg溶液，离心80g，5min，弃上清
，补至每个样品100μl 原生质体
mL离心管，每100μl 原生质体，加入20μl质粒和120μl新鲜制备的40%的PEG4000，混匀
℃避光静置转化20--25min
mL W5溶液混匀，80g离心3min，弃上清。

W5溶液重悬，轻轻混匀，移到细胞培养板，锡箔纸包裹避光28℃避光静置培养15-20小时
，将培养板中沉淀的原生质体轻轻混匀，吸到2 mL离心管中，80g离心3min，弃上清，保留100μl上清液

配制溶液方法：
I：配成母液
试剂名称
MW
母液浓度
质量
配制体积
甘露醇（D-Mannitol）

M

500mL
CaCl2

1 M

50mL
BSA
2%

20mL
KCl

M

50mL
MES

M

50mL
MgCl2·6H2O



50mL
PEG4000
现配(W/V)
酶液
试剂
10mL
30mL
终浓度
Cellulase RS


%
Macerozyme R-10


%
D-Mannitol



MES
1mL
3mL