***标记核酸探针的标记方法
核酸探针已被广泛用于筛选重组克隆、基因多样性的种性检测和真菌种群及种群之间的系统发育关系评价。最早使用的放射性同位素标记核酸探针具有敏感性高、特异性好、分辨力强的特点,但放射性同位素标记也存在着一系列令人困扰的问题,如成本高、探针半衰期短、放射性物质危害人体健康等。而且在进行放射性同位素标记实验时,需要有专门的实验室及相应的实验保护设施,还需要由经过培训的专业人员来操作,因而限制了在普通实验室进行分子生物学实验。
近几年发展起来的非放射性核酸探针大多通过酶促、光化学和化学手段掺入一种报道基团,这种报道基团可通过高灵敏度的冷光、荧光或金属沉淀等检测系统检测。另外,应用pH电极或感应器技术的电化学检测系统也有报道。在这些检测系统中,灵敏度最高的是生物素- 亲合素检测系统和半抗原-抗半抗原***检测系统。由于生物样品中常含有源性生物素及生物结合蛋白,生物素标记的核酸探针会发生一些非特异性结合,从而影响实验效果。与生物素-亲合素系统同样具有高灵敏度,却减少了非特异性结合的***检测系统,已为人们所接受,并得到广泛的应用。
***(Digoxigenin ,DIG) 又称异羟基洋地黄毒甙元,是一种类固醇半抗原分子。其化学结构如图1 所示。
采用人工方法可以将***的线型间隔臂与dUTP 连接起来,形成DIG-11-dUTP,通过随机引物法或PCR法将其掺入到DNA探针中。RNA探针的标记是使用噬菌体信息编码的RNA聚合酶,通过体外转录将DIG-11-dUTP掺入到RNA探针中。寡核苷酸探针的标记则是通过末端转移酶催化,在3'末端加上DIG-11-dUTP/dATP 或DIG-11-ddUTP 尾巴。
对于目的DNA 或RNA 来说,分子杂交后,杂交部分可通过ELISA 实验程序加以检测,即加入一种结合有碱性磷酸酶的***-特异性抗体,它与***半抗原分子形成酶联抗体-半抗原(DIG) 复合物,再加入相应的显色底物,使杂交部分得以显示。
1 ***标记核酸探针的主要标记方法
1. 1 DNA 探针的标记方法
1. 1. 1 PCR 掺入法 这种标记方法是通过聚合酶链式反应,在Taq 酶的作用下,将DIG-11-dUTP 掺入到新合成的DNA 链中。以本法标记的探针不但灵敏度高,产量也很高。少量的基因组DNA(1ng~50ng) 便可直接通过PCR 进行扩增、标记。
1. 1. 2 随机引物法 用随机引物法可将DIG-11-dUTP 标记于DNA 链上。为得到最佳标记效果,标记前模板DNA 需作线性处理,而且至少要用苯酚-***仿进行一次抽提,再用乙醇沉淀。 100~10000 碱基的模板链均可被有效地标记,但大于10000 碱基的模板链则需要在标记前作限制酶切消化。处理好的模板加入随机引物,按碱基互补原则,随机引物与模板DNA 退火后由Klenow 片段从引物3' 端延伸引物,便可将DIG-11-dUTP 均匀掺入到新合成的DNA 链中。
1. 1. 3 切口平移法 切口平移法D
地高辛标记核酸探针的标记方法 来自淘豆网www.taodocs.com转载请标明出处.