环介导等温扩增快速检测病原菌新型试剂盒研制可研专业技术方案.docx

环介导等温扩增快速检测病原菌新型试剂盒研制
可行性研究报告
李思光
南昌大学
一、选题的必要性
1、工程所处技术领域产业政策
本工程属生物高技术领域，是国家重点支持的研究领域，工程 主要针对严重影响人类健康的主要病原菌的检测与诊断需要进行检 测技术的研究与试剂盒的开发，本工程的实施可产生具有自主知识 产权的科研成果。本工程技术含量高，市场竞争力强，工程完成后 能够产生较好的经济效益和社会效益，工程符合国家产业、技术政 策。
2、工程所处技术领域技术发展现状
目前的病原菌检测方法费时、费力、准确性低，开发快速、准 确、低成本的检测技术和配套试剂是病原菌检测工作中亟待攻克的 难题。本工程针对病原菌检测中存在的问题，采用高灵敏度、高特 异性的环介导等温扩增技术开发出简便、快速、经济的检测试剂。
3、工程技术先进性，对相关领域技术进步的推动作用
环介导等温扩增是利用 4 个特殊设计的引物和具有链置换活性
的DNA聚合酶，在恒温条件下特异、高效、快速地扩增 DNA的新技 术。该技术在1h内能扩增出109靶序列拷贝。LAMP技术以其特异性 强、灵敏度高、快速、准确和操作简便等优点在核酸的科学研究、 疾病的诊断和转基因食品检测等领域得到了日益广泛的应用。该技 术的推广对生物学、食品科学及医学领域中的检测和诊断技术的进 步有推动作用。
4、工程目前进展情况 课题组开展了大量前期研究工作，已完成了本工程所需的科研 平台建设任务，开展了嗜水单胞菌和金黄色葡萄球菌的环介导等温 扩增研究，取得了阶段性研究成果，这些工作为本工程的顺利完成 奠定了基础。
二、技术方案论述
工程技术关键点和创新点，工程完成时达到的技 术水平
1 、技术关键
本工程的技术关键之一是引物设计。与常规 PCR引物不 同，环介导等温扩增引物设计难度大，一组引物要求有 6 个位点与 靶序列完全匹配才能够进行扩增。目前我们已从国际基因组数据库
中下载了部分病原菌的基因组 DNA并根据基因组特点采用等温扩 增软件设计了部分引物，现正通过实验确定这些引物的性能。
本工程的另一技术关键是最佳等温扩增体系优化。通过
对引物浓度、内引物和外引物的最佳浓度比、模板浓度、 dNTP浓
度、BstDNA聚合酶用量、Mg+浓度等条件进行优化，能够获得最佳
实验条件
2、创新点
（1）既往对病原菌的检测一般采用细菌分离培养鉴定法，但该 方法的准确率低，所需时间长，往往延误临床正确的诊断和治疗。 近年来，人们将PCR技术用于病原菌的检测。PCR技术虽然较传统 方法灵敏、快速，但需要较昂贵的仪器设备。更为重要的是，
PCR
方法容易产生非特异性扩增产物，造成假阳性和假阴性结果，影响 对样品的正确判断。本工程将建立适合于食品和临床标本大规模检 测的环介导等温扩增快速检测病原菌技术。与目前的检测方法相 比，等温扩增法具有快速、准确、灵敏的特点。而且，等温扩增法 是在恒温下进行，只需一个简单的恒温装置，不需要 PCR实验中的
昂贵仪器，因而易于在基层食品质量检测部门和医院推广使用。
（2）目前，国外已有将环介导等温扩增技术应用于病毒 DNA
和RNA检测的报道，但将其应用于病原菌检测的文献报道极少，国 内基本上还未开展环介导的等温扩增研究工作。本工程首次提出将 环介导的等温扩增技术应用于食品和临床标本中病原菌的检测，并 对目前的等温扩增方法提出改进策略，发展可同时检测多种病原菌 的多重等温扩增技术，以克服当前一个等温扩增反应只能检测一种 DNA或RNA的缺点。因此，本工程的实施，将开发出具有自主知识 产权的病原菌检测试剂盒。
3、工程完成时达到的技术水平 工程完成时，开发的多重环介导等温扩增快速检测病原菌技术
及其配套试剂盒达到国际先进水平
（二）工程技术方案
1、技术方案
（1） 环介导等温扩增（LAMP和多重等温扩增快速检测常见 病原菌方法的建立
常见病原菌特异性LAMP引物的设计。根据Ge nBank数据库 公布的常见病原菌
DNA序列，采用LAMP专用引物设计软件设计特异 性LAMP引物（包括每类致病菌的两个外引物、两个内引物和两个环 引物，其中每个内引物均具有两段能够识别靶分子上特定位点的序 列，以保证靶序列的特异性扩增。）
常见病原菌基因组DNA的提取。采用本实验室建立的基因组 DNA快速提取技术提取致病菌DNA
LAMP扩增反应体系的优化：对引物浓度、内引物和外引物的 最佳浓度比、模板浓度、dNTP浓度、BstDNA聚合酶用量、Mg+浓度 等条件进行优化。
温育条件的优化：在55-65 C之间优化等温扩增温度。
扩增产物的检测：建立快速显色法和电泳分析法两种检测扩 增产物的方法。
以上述研究结果为基础，建立