小鼠腹腔巨噬细胞吞噬试验.ppt

小鼠腹腔巨噬细胞吞噬试验
武汉大学基础医学院
免疫学教研室
熊 洁
.
原 理（体外法）
巨噬细胞具有吞噬异物的功能，将巨噬细胞与被吞噬物(鸡红细胞、白色念珠菌、白色葡萄球菌等)共同温育，染色，在油镜下计数吞噬异物的巨噬细胞的吞噬百分率和吞噬指数，以此判断巨噬细胞的吞噬功能，从而评价机体的免疫状态。
本实验拟检测小鼠腹腔巨噬细胞对白色念珠菌的吞噬功能。
.
材 料
1．小白鼠
2．白色念珠菌液（美兰染液着色）
3．6％可溶性淀粉肉汤
肉汤培养液100 m1，加入可溶性淀粉6g，混匀后煮沸灭菌
4．小鼠解剖器械、显微镜、离心机、温箱等
5．试管、吸管、微量加样器、计数板
.
方 法
(1)、小鼠巨噬细胞制备
实验前三天每只小鼠腹腔注射1％可溶性淀粉1ml。实验时眼球放血、断椎处死小鼠，新洁尔灭浸泡5分钟。
剪开腹部皮肤，暴露腹膜，用镊子夹起腹膜剪开一小口(注意避开血管)，用1640灌注腹腔，收集腹腔液于试管中(约4 ml)，1500 r/min，离心10 min，去上清，沉积细胞用1640离洗一次。最后沉积细胞用含10％小牛血清1640配成适当浓度备用(1-2×106／ml)。
.
（2）白色念珠菌制备 将白色念珠菌接种于沙氏平皿培养基中，培养48小时，收集菌，用适量生理盐水配成悬液，100℃，煮沸30 min灭活，离心去掉上清，再用1％美兰染色30 min，用生理盐水洗涤二次，用生理盐水配成1×108／ml菌悬液，4℃冰箱保存备用。
.
（3）吞噬细胞与菌混合培养
，置37℃温育30min。
取1滴混合液置玻片上加盖玻片，在高倍镜下观察计数。
.
.
高倍镜下观察计算：
吞噬率％=(吞噬白色念珠菌的巨噬细胞数/100个巨噬
细胞)×100％
吞噬指数％=100个巨噬细胞中吞噬白色念珠菌总数
/100个巨噬细胞
**(吞噬指数式中巨噬细胞为阳性吞噬细胞)
.
注 意 事 项
1、菌与细胞混合后充分混匀非常重要。对于此实验，菌与吞噬细胞之比10：1时吞噬作用容易观察和计数。但是吞噬效果好，能真正反映实际情况又可被检测的比例为1：1。
.
2、菌和细胞在摇床中作用的时间不超过30 min，如果在37C 条件下作用时间过长，被吞噬的菌很快会被裂解，也就不能计数为吞噬了菌的细胞。
.