创伤弧菌对血管内皮细胞损伤作用的初步研究.pdf

⋯⋯创伤弧菌对血管内皮细胞损伤作用的初步研究课题来源:广东省自然科学基金项目专名称学位申请人指导教师答辩委员会主席答辩委员会成员病理学与病理生理学李艳申洪教授丁彦青教授王连唐教授钟雪云教授张雅洁教授李建明教授论文评阅人苏敏教授韩安家副教授陈清教授业年广州南方医科大学级硕士学位论文●■一
创伤弧菌对血管内皮细胞损伤作用的初步研究硕士研究生:李艳指导教师:申洪教授摘要研究背景和目的:类创伤感染和原发性败血症的主要致病斟,一般通过外伤接触含病菌的海水或其引发的多器官功能障碍综合症是脓毒败血症患者死亡的主要原斟,病死率高方法:创伤弧菌,腔【舻谖迦合妇锢既旧跣裕淝杆状、多形性、运动活泼、有荚膜的细菌,主要生长于海水中的鱼类及贝母类等体内,为嗜盐性海生弧菌【俊?煞治种生物型、、,其中褪堑贾氯生食海鲜两种途径感染R虼舜瓷嘶【腥臼呛I洗瓷艘窖е械闹匾N侍猓是海产品食品卫生中的重要问题。其感染后可引起人体严重感染、脓毒败血症,达%以上。创伤弧菌脓毒败血症的形成主要是大量的创伤弧菌侵入到血液之中,而血管内皮细胞是阻挡创伤弧菌进入血管的重要屏障】。因此,创伤弧菌对血管内皮细胞的损伤作用及机制是创伤弧菌败血症形成机制中的重要问题。为揭示创伤弧菌对血管内皮细胞的损伤作用,阐明创伤弧菌感染时对人血管内皮细胞结构的影响,我们进行了本项研究,为临床创伤弧菌感染的诊治提供一定的理论依据。瓷嘶【话闾匦怨鄄旌投匝9苣谄は赴挠跋欤创伤弧菌标准株鹤灾泄蒲г何⑸镅芯克胀ㄎ⑸硕士学位论文
核的长轴瓣甤,神赴牒说亩讨“,“,轴比铡盐—枸橼酸盐一胆盐一蔗糖琼脂保藏管理中心。复苏培养后,行革兰氏染色,光镜观察,划线接种于硫代硫酸,桨及普通营养琼脂平板观察其菌落形态,并接种于弧菌属生化鉴定管及生化条培养螅料妇ń峁人脐静脉血管内皮细胞,祝广州军区广州总医院实验科提供,对其进行因子免疫荧光鉴定。我们通过本课题组前期的实验结果‘】,对创伤弧菌对血管内皮细胞的攻击浓度进行了界定,并通过孔板培养实验以及ǘ圆煌ǘ鹊拇瓷嘶【窒难9内皮细胞进行增殖抑制率的测定;细胞划痕实验测量不同浓度的创伤弧菌对细胞迁移能力的影响;台盼蓝拒染法检测细胞侵袭后即刻及赴婊盥剩涣式细胞仪测定不同浓度对./细胞凋亡的影响,选择攻击实验的最高的实验终浓度痬Mü鼿ü馊旧ü鄄霩赴说谋浠平板克隆形成实验检测细胞集落形成能力的变化,以及个高倍视野下正常细胞与侵袭后细胞核分裂数的变化,观察极限杀伤浓度下细胞生物学行为的变化。对正常组和创伤弧菌攻击组痬的细胞爬片进行细胞面积和周长、细胞核的面积、胞浆面积⒑私以及细胞与细胞与核的形状因子、,细胞与核的形状因子、,细胞与核的规划形状因子腇心巫床还嬖蛑甘鼺等参数的体视学测量以检验人脐静脉内皮细胞在创伤弧菌攻击下增殖能力和细胞形态的改变。⒋瓷嘶【诙舅氐奶崛⒓ㄒ约岸匝9苣谄は赴挠跋取新鲜培养的创伤弧菌,利用酚水法提取细菌内毒素⒍訪进行离心纯化,以及根据版《中国药典》规定用内毒素测定方法“鲎试剂”对其进行鉴定,并绘制浓度曲线,确定所提取的细菌呐ǘ取选择创伤弧菌内毒素对细胞的半数致死浓度,选择其上下浓度域共中文摘要Ⅱ
结果:浓度对人脐静脉内皮细胞进行桨蹇寺。凼笛椴舛ㄏ赴ㄒ颇芰Φ改变,以及流式细胞仪对细胞凋亡率的测定。对正常组和内毒素痬击组的细胞爬片进行细胞面积和周长、细胞核的面积、周长、细胞的体积约跋赴奶寤芏⒈砻婊芏⑹密度等参数的体视学测量以检验人脐静脉内皮细胞在创伤弧菌攻击下增殖能力和细胞以及细胞核形态的改变,以判断细菌内毒素对人脐静脉内皮细胞损伤程度。⒋瓷嘶【芟赴舅氐募ê团ǘ鹊牟舛ǎ约捌涠匝9苣谄は赴挠响本课题组前期已重组大肠杆菌/甤,行蓝白斑筛选,挑选白色菌斑进行┰龅玫酱瓷嘶【芟赴舅云进行甈缬狙橹ぃ捎肂法进行蛋白定量,绘制标准曲线,计算蛋白浓度。对禕痚小鼠进行腹腔皮下多点注射,/,小鼠处死后对其立即解剖,取主要损伤脏器及组织固定、石蜡包埋后按常规方法制片、染色,光镜下观察病理变化。选择创伤弧菌溶细胞毒素对细胞的半数致死浓度,选择其浓度域上下共雠ǘ榷匀似昃猜瞿谄は赴蠱,平板克隆,划痕实验测定细胞迁移能力,并用流式细胞仪对细胞凋亡率的测定。对正常组和溶细胞毒素痬セ组的细胞爬片进行细胞面积和周长、细胞核的面积、周长以及细胞的体积密度、表面积密度、数密度等参数的体视学测量以检验人脐静脉内皮细胞在创伤弧菌溶细胞毒素攻击下增殖能力和细胞形态的改变,以判断细菌溶细胞毒素对人脐静脉内皮细胞损伤程度。创伤弧菌暝赥桨迳仙のB躺ň洌泄庠螅5湫偷恼液菌落;普通营养琼脂平板上生长为黄白色粘液半透明菌落。生化鉴别结果:“创伤弧菌%下。硕士学位论文Ⅱ
流式细胞仪测定不同浓度对叫细胞凋亡的影响,创伤弧菌攻击组细胞凋亡短轴直鹞#..赴婊岬分别为:.和.,细胞周长分别为:..岜确细胞吸光率的测定,痳组、血/瑚组、/组、