免疫组化染色技术.doc

[分享] 免疫组织化学染色技术
法医学院 官大威
第一节 常规组织学染色技术概述
宏观微观超微结构基因水平
组织形态学研究技术的种类：
一、病理大体组织标本的染色方法
在标本制作中，为了某种特殊目的，突出显示标本的重要部分，借助组织切片的特殊染色方法对标本进行染色，将病变器官及不同组织成分用染料染成不同的颜色，以便于区分大体标本的不同成分和病变特点，如：
..脂肪组织染色法
目的：主要用于心、肝、肾脂肪变性，动脉粥样硬化大体标本的染色
试剂：丹Ⅲ或丹Ⅳ
结果：病变处脂肪组织呈橙黄色
..早期心肌梗死染色法
目的：显示早期心肌梗死的区域
试剂：% NBT(硝基四唑蓝) / mol / L PBS(pH )
方法：将2-3 mm 厚新鲜心肌大片放入试剂中，37 °C 孵育20 min。
结果：正常心肌呈蓝色，早期心肌梗死区、纤维结缔组织、瘢痕组织呈浅蓝色或不显色。
注意：新鲜标本，尸检心肌不超过6小时。
二、光学显微镜下的组织学染色方法
.常规HE染色（hematoxylin and eosin staining）
.组织学特殊染色
1. Mallory 三染色、Masson三染色
2. 神经纤维的镀银染色
3. 其他的特殊染色，包括钙、铁、铅、铜、黑色素和脂褐素、细胞DNA和RNA的染色等
上述的各种染色方法只能在细胞水平上显示组织结构的形态改变。
三、超微结构的观察
.光线波长的限制，
有效放大倍数最高不超过2000倍。
，放大倍率最高可达100万倍。
第二节免疫组织化学染色技术 Immunohistochemical technique
由于该技术主要是用于研究和观察细胞中的某些结构或分子物质和组织细胞间的成分，因此现又称为免疫细胞化学技术。
根据标记物的不同，免疫细胞化学技术可分为：
1. 免疫荧光细胞化学技术
2. 免疫酶细胞化学技术
3. 免疫铁蛋白技术
4. 免疫金-银细胞化学技术
5. 免疫电子显微镜技术
一、免疫组织化学染色方法的原理
.抗原（antigen）
1. 定义：是一类在适合条件下能激发机体免疫系统发生免疫应答，并能与免疫应答产生的效应物质（抗体和效应细胞）在体或体外发生特异性结合反应的物质。抗原具有两种性能：
（1）免疫原性（immunogenicity）指抗原分子具有诱导机体产生免疫应答的特性。
（2）反应原性（reactogenicity）指抗原分子与抗体或效应T 细胞等免疫应答产物发生特异性反应的特性。
2. 抗原的分类------完全抗原、半抗原
免疫学分类
胸腺依赖抗原与非依赖抗原
外源性抗原：微生物、花粉等
源性抗原：隐蔽的自身抗原、肿瘤相关抗原等
临床分类同种异型抗原：人类白细胞抗原、血型抗原
异嗜性抗原：人与其他动物、植物等之间存在的共同抗原
.抗体（antibody）
1. 定义：机体受到抗原刺激后，通过体液免疫应答，B淋巴细胞活化、增殖，分化为浆细胞，由浆细胞合成并分泌的仅与该抗原发生特异性反应的球蛋白，称为抗体。
大部分抗体电泳后位于γ区带，1972年国际免疫学联合会正式将化学结构相同或相似的一类球蛋白分子统一命名为免疫球蛋白(immunoglobin，Ig)。
2. 抗体的种类:五类，即IgA、IgD、IgE、IgG、IgM
免疫组织化学染色技术中，使用的抗体主要是IgG，个别情况下使用IgG的亚型，多为IgG1。
.免疫组织化学染色的反应原理及显色原理
1. 免疫组织化学染色的反应原理
..染色反应的最基本原理是抗原抗体的反应。
..通过对针对标本中相应抗原的抗体上标记某种发色剂或酶类，再通过激发发色剂或使用某种显色剂，在显微镜下使标本中抗原抗体反应的部位产生肉眼可观察到的颜色以确定所要检测的抗原是否存在。
..通过免疫组织化学染色技术，在光学显微镜下即可检测到所要研究的蛋白分子类物质的存在与否。
2. 免疫组织化学染色的显色原理
(1) 基本原理
荧光标记或酶标抗体的染色分为直接法和间接法。其中以酶标抗体法应用最为广泛。
n直接法：是将酶直接标记在第一抗体上，用酶标抗体与切片上待检测的组织或细胞中抗原反应，再用底物显色，显示出所检测的目的抗原的部位。
n间接法：是将酶标记在第二抗体上，检测组织或细胞的特异性抗原物质。
..间接法中所用的一抗是针对组织或细胞中某种抗原的特异性抗