血清谷丙转氨酶活性的测定参考课件.ppt

赖氏法测定血清谷丙转氨酶活性(ALT)的测定
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【目的要求】
。
。
。
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【实验原理】
ALT催化丙氨酸与α-***戊二酸之间的氨基转移,生成***酸和谷氨酸,在37℃, ,经30min反应之后，加入2,4-二硝基苯肼终止反应,并与反应中的二种α-***酸生成2,4-二硝基苯腙,在碱性条件下显红棕色,于波长505nm处读取A值。
两种苯腙的吸收光谱曲线在500~520nm处差异最大,***酸苯腙的呈色强度是α-***戊二酸苯腙的3倍,据此可以计算出***酸的生成量,后者与血清中的ALT的活性浓度成正比。
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【实验原理】
丙氨酸+
α-***戊二酸
***酸+谷氨酸
ALT
2,4-二硝基苯肼
α-***戊二酸-2,4-二硝基苯腙
***酸-2,4-二硝基苯腙
0. 4mol/LNaOH
红棕色
红棕色（三倍）
卡门单位:1ml血清在25℃,340nm,体积为3ml,。
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1、主要器具
微量移液器
【实验仪器】
可见分光光度计
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【实验试剂】
1．（）
2．基质缓冲液
精确称取D-L-,α-***,,用1mol/L ,再加磷酸盐缓冲液至100ml,每升底物缓冲液中可加***仿防腐,4℃保存。
3． 2，4-二硝基苯肼溶液
4． NaOH溶液
5．***酸标准液
6．待测标本: 病人血清或质控血清。
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【操作步骤】
（1）待测血清的测定
加入物(ml)
对照管
测定管
血清


基质缓冲液

混匀，37℃水浴30min
2，4-二硝基苯肼溶液


基质缓冲液

混匀，37℃保温20min
NaOH溶液


混匀，室温放置5min，在波长为505nm处比色，蒸馏水调“0”
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【操作步骤】
（2）校正曲线的制备
加入物(ml)
0
1
2
3
4






***酸标准液
0




基质缓冲液





2，4-二硝基苯肼溶液





混匀，37℃保温20min
NaOH溶液





卡门单位
0
28
57
97
150
混匀，室温放置5min，在波长为505nm处比色，蒸馏水调“0”
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取7支试管，按下表操作
卡门单位
0
28
57
97
150
加入物(ml)
对照管
测定管
0
1
2
3
4
血清


基质缓冲液

混匀，37℃水浴30min






***酸标准液
0




基质缓冲液





2，4-二硝基苯肼溶液







基质缓冲液

混匀，37℃保温20min
NaOH溶液







混匀，室温放置5min，在波长为505nm处比色，蒸馏水调“0”
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【实验结果】

以标准管各管的A值-“0”号管的A值,所得差值与对应酶卡门氏单位作图,即成校正曲线。

测定管A值-对照管A值,根据所得差值，从校正曲线查得标本中ALT的卡门氏单位。
参考值范