DB37-T 3572-2019 牛乳中A2型β-酪蛋白（A2奶）检测技术规程.doc

ICS 
B 40
     
DB37
山东省地方标准
DB 37/T 3572—2019
     
牛乳中A2型β-酪蛋白（A2奶）检测技术规程
Code of practice for detection of A2 type of β-casein (A2 milk) in cow's milk
2019 - 05 - 29发布
2019 - 06 - 29实施
山东省市场监督管理局   发布
目  次
前言 II
1 范围 1
2 规范性引用文件 1
3 术语和定义 1
4 检测原理 1
5 主要试剂配制 2
6 主要仪器设备 2
7 质谱检测及数据处理参数 2
8 检测方法 2
样本采集 2
蛋白提取 2
蛋白质的消化 2
质谱鉴定 3
9 结果判定 3
SDS-PAGE鉴定 3
A2型β-酪蛋白的判定 3
10 废弃物的处理 3
11 检测过程中防止交叉污染的措施 3
附　录　A （资料性附录） 主要试剂配制 4
附　录　B （资料性附录） 主要仪器设备 6
附　录　C （资料性附录） 蛋白检测参数及结果 8
前  言
本标准按照GB/T —2009给出的规则起草。
本标准由山东省畜牧兽医局提出并监督实施。
本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。
本标准起草单位：山东省农业科学院奶牛研究中心、山东奥克斯畜牧种业有限公司、山东省畜牧总站、大同市南郊区四方高科农牧有限公司、中国农业大学、江苏省农业学院畜牧研究所。
本标准主要起草人：黄金明、王秀革、鞠志花、姜强、王玲玲、张思聪、张亚冉、魏晓超、高亚平、刘文浩、高运东、侯明海、杨国瑞、戴蕴平、仲跻峰。
牛乳中A2型β-酪蛋白（A2奶）检测技术规程
范围
本标准规定了牛奶和奶粉中A2型β-酪蛋白（A2奶）的检测方法。
本标准适用于牛奶和奶粉中A2型β-酪蛋白（A2奶）的检测。
规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682　分析实验室用水规格和实验方法
GB/T —2004　转基因产品检测　实验室技术要求
GB/Z 35959—2018　液相色谱-质谱联用分析方法通则
术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
A2型β-酪蛋白　A2 β-casein；A2 CSN2
β-酪蛋白由224个氨基酸（含有15个氨基酸的信号肽）组成，具有不同的变体型（A1、A2、A3、B、C、E、F、H1、I），当第51位、52位、82位、103位、108位、121位、137位、167位氨基酸分别为谷氨酸、谷氨酸、脯氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、组氨酸、丝氨酸、脯氨酸时，称为A2型β酪蛋白。
A2奶 A2 milk
所含β酪蛋白为A2型的牛奶称为A2奶。
质谱法　Mass spectrometry；MS
试样被电离后，形成不同质荷比的离子，根据这些离子的质量数和相对丰度分析试样的方法。
质荷比　Mass-to-charge ratio
离子的质量m与其所带的电荷数z之比，以m/z表示。
检测原理
β-酪蛋白变体型对应不同的氨基酸突变位点（ E＞K、 E＞K、 P＞H、 L＞I、 M＞L、 H＞Q、 S＞R、 P＞L）（参考序列：GenBank ），而不同氨基酸之间存在分子量差异。利用质谱分析技术，根据质荷比差异将样品蛋白质中存在氨基酸突变的肽段鉴定出来，从而确定氨基酸突变位点，实现对不同变体型β-酪蛋白检测的目的。
主要试剂配制
实验所用水为符合GB/T 6682规定的双蒸水；高压灭菌条件为121 ℃，×105 Pa压力，蒸汽灭菌20 min。试剂配制见附录A。
主要仪器设备
见附录B。
质谱检测及数据处理参数
见附录C。
检测方法
样本采集
待检测的新鲜牛奶
每头奶牛采集新鲜牛奶（排除头奶或末乳）50 mL，充分混匀后，-80 ℃保存。
待检测的商品化奶粉
包装未开封，常温储存。
蛋白提取
从-80 ℃取出牛奶样本，常温解冻后充分混匀，取样50 μL，或称取奶粉样本30 mg。
向上述样品中加入500 μL裂解液【8 M尿素，30 mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）】。冰上裂解10 min。离心，4 ℃，20 000 g，30 min。取上清，避