抗原抗体反应.pptx

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上章小结：
一﹑基本概念 主要组织相容性复合物等
二﹑MHC抗原的结构和功能
MHC-I MHC-II结构、功能及两者与肽结合的区别
三﹑MHC抗原基因多态性及结构
四﹑MHC的检测原理和应用
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第七章
抗原抗体反应及应用
一节﹑抗体的制备
二节﹑抗原抗体反应
三节﹑抗原抗体反应的应用
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一节﹑抗体的制备
一﹑抗血清的制备及抗体纯化
二﹑单克隆抗体的制备
三﹑ 抗体工程
四﹑ 催化性抗体
五﹑ 抗体在抗肿瘤治疗中的应用
继续
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一﹑抗血清的制备及抗体纯化
1、抗血清的制备
抗血清：含有能与相应抗原结合的抗体分子的免疫动物血清。
③抗血清的纯化 见下图
①免疫动物 抗原(半抗原需经转化)
佐剂乳化 免疫动物
②抗血清的制备 抗血清的效价测定
采血 获得抗血清
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抗血清+3倍体积0℃ddH2O,
加50% -20℃酒精至最后质量分数为20%(保持-5℃)
上清
沉淀(含IgG/IgA/IgM/杂蛋白)
-,(<0℃)
上清液
沉淀(含IgA/IgM/杂蛋白)
, -20至-30℃95%酒精至最后质量分数为25%，维持在-6 ℃
上清
沉淀(IgG)
悬浮于ddH2O,
上清液
沉淀
,—,加50%冷酒精至最后质量分数为10%(-3℃)
沉淀(IgA/IgM)
上清
通过分子筛将二者分开
2、抗体
初步纯化
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抗血清的初步纯化只是多数抗体类别的纯化。
上述冷酒精沉淀法是1946年Cohn创立的较好方法。该法得到的只是较粗Ig。
硫酸铵盐析法：比较简便，蛋白质变性小，33%饱和硫盐沉淀各类Ig，分离纯度较差。浓盐使IgA形成二聚体，不宜采用。
离子交换层析法：通过层析法，才能获得高纯度某一类Ig。
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3、抗体进一步纯化
IgG在血清中含量最高，占75—80%，纯化的方法常用33-50%硫铵盐析和DEAE-纤维素柱层析法。
，其它血清蛋白都带负电荷，因此可用阴离子交换剂DEAE-纤维素一次将IgG提纯到很高的纯度。
分离纯化IgM常用18%硫铵沉淀，再DEAE-纤维素柱层析，收集洗脱液，再用分子筛分离，获纯化的IgM。
获得的纯化Ig，在4℃保存，长期保存需在-20℃以下。
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问题：血清中的抗体是由多个抗原决定簇刺激B细胞克隆而产生的抗体，是多克隆抗体(PAb)，通过分离的方法不可能获得真正的单一抗体。
如何获得大量的一种抗体？
由单一B细胞克隆而产生的抗体，称单克隆抗体(MAb)。
二﹑单克隆抗体的制备
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1 、制备MAb(monoclonal Ab,mAb)的原理
利用B细胞能分泌抗体而肿瘤细胞能在体外长期培养并可低温保存的优点，通过细胞杂交，融合二类细胞，从而筛选得到既有抗体分泌性又有不断分裂性的杂交瘤细胞，将其细胞单克隆化。
用单克隆化的杂交瘤细胞进行单克隆抗体的生产，称为杂交瘤技术。
öhler & Milstein创立的。
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2、制备MAb的基本过程
免疫小鼠品种、加强
3d
脾脏
单细胞悬浮
洗掉血清
骨髓瘤细胞营养缺陷型
PEG
HAT培养基
37℃
5%CO2
选抗体
分泌株
克隆阳性细胞,1细胞/孔
增殖阳性克隆
-70℃或液氮