苏云金芽胞杆菌Cry1Ac毒素对棉铃虫作用机理研究.pdf

湖南师范大学
硕士学位论文
苏云金芽胞杆菌Cry1Ac毒素对棉铃虫作用机理的研究
姓名:田野
申请学位级别:硕士
专业:生物学·微生物学
指导教师:夏立秋;丁学知
20081201
苏云金芽胞杆菌鷆銎鲂唤婿阺拈,简称且恢址要摘布广泛的革兰阳性细菌,伴随芽胞形成产生杀虫晶体蛋白,简称芄欢旧卑鄢目、双翅目、鞘翅目等九个目的嘀掷コ妫还惴河τ糜诤Τ娣治。棉铃虫是世界性重要农业害虫,随着杀虫剂的广泛使用和转基因棉花的广泛种植,棉铃虫的抗性问题已经成为制约生物农药产业发展的瓶颈,更深入地了解对鳞翅目昆虫的作用机理,对于研究合理使用、制定延缓昆虫抗性发展的策略具有重要意义。本研究以Q芯烤辏靡禾逅喾掷法初步提取毒素晶体蛋白,采用等电点沉淀法进行纯化,然后将所得毒素蛋白溶解,最后经凝胶过滤层析,收集贤馕辗宓鞍籽品,狿治龅玫礁叽慷取⒏吲ǘ鹊腂毒素。本研究以四龄棉铃虫幼虫为供试昆虫,通过差速离心法,成功分离到棉铃虫幼虫中肠刷状缘膜囊,采用法分别对其提取后的组织碎片、离心上清液、离心沉淀中的蛋白含量进行测定,发现大部分蛋白质都存在于提取的中肠离心沉淀中。利用生物素标记毒素活化片段,进行体外竞争结合印迹分析,在大约γ飨杂幸惶醯ヒ坏牡鞍滋醮黾游淳素标记的毒素含量,蛋白条带呈现减弱趋势,毒素与的结合相对量也不断降低,当未经生物素标记的毒素含量增加为初始浓度的妒保舅赜隑慕岷舷喽粤坑煽J嫉%下降为%,相对降低了约%。表明毒素相互之间能够发生同源竞争结合,制备的毒素和棉铃虫中肠能够用于后续试验,具有较高的生理活性。采用狿兔庖吖渤恋砑际跹芯勘砻鳎珻舅囟悦蘖虫中肠总蛋白量和棉铃虫中肠受体蛋白都产生明显影响。与未
过娓呶麓砗蠖舅毓丫厶逋耆ń饫胛6舅氐ヌ濉饲喂毒素棉铃虫相比较,毒素作用后的棉铃虫中肠小分子量蛋白条带出现丢失,尤其是在蛋白表达量上表现出较大差异,特别是成功分离到一种的蛋白,经过质谱分析鉴定为氨肽酶⑶抑谐受体蛋白氨肽酶泶锪恳裁飨栽黾印采用技术研究毒素寡聚体形成能力,结果表明毒素在棉铃虫中肠中能够形成二聚体和四聚体,经研究毒素作用前后对棉铃虫幼虫病理学的影响发现,与正常棉铃虫幼虫相比,饲喂毒素的棉铃虫幼虫形态和发育都发生明显变化,利用透射电镜观察发现,苏云金芽胞杆菌毒素主要影响棉铃虫幼虫中肠细胞微绒毛,导致微绒毛明显变短变粗,顶端出现空泡,随后部分微绒毛发生溶解脱落。关键词:苏云金芽胞杆菌;毒素;免疫共沉淀;受体蛋白;病理学
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∞缩略词表苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白乙二胺四乙酸千道尔顿半致死浓度聚丙烯酰胺凝胶电泳十二烷基硫酸钠磷酸盐缓冲溶液氨肽酶刷状缘膜囊泡%巧猙
司好⒈C芸冢凇杲饷芎笫视帽臼谌ㄊ椤昂湖南师范大学学位论文原创性声明湖南师范大学学位论文版权使用授权书日期:枷分年,工月本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名:二孑年,工月本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属湖南师范大学。同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅。本人授权湖南师范大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。朐谝陨舷嘤Ψ娇蚰诖颉皛/导师签本学位论文属于⒉槐C芸凇作者签名:/日工/日
言苏云金芽胞杆菌遚川螂历缈觇孽彪琊括,简称且恢衷谧匀可将其归属为第二类第十八群芽胞杆菌属鱟,,年从德国苏云金苏云金芽胞杆菌的细胞生物学特性界广泛分布的革兰氏阳性细菌,按照《伯杰氏细菌鉴定手册》第九版年日本学者石渡首先从患猝倒病的家蚕中分离到苏云金芽胞杆菌猝到另一株类似的细菌之后,年才正式将此昆虫病原细菌命名为苏云金芽胞杆菌【俊苏云金芽胞杆菌在土壤、病死昆虫、储藏物、植被以及污水、尘埃等基质中均有广泛的分布,而土壤作为微生物的大本营,也是苏云金芽胞杆菌分布最为丰富的生境,但是其在土壤中分布表现出一定的地域特性,且分布数量与土壤