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《DNA测序技术》PPT课件.ppt


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文档列表 文档介绍
从国际谈发展
1
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DNA测序技术
第一代:双脱氧末端终止法
化学降解法
第二代:DNA序列分析的自动化
第三代:新一代DNA测序技术
2
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第一代
70年代末,Sanger发明双脱氧核苷酸末端终止法,到现在仍为绝大多数实验室常用的DNA序列分析方法。
同期,WalterGilbert发明化学降解法。
3
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双脱氧末端终止法原理
2’端羟基被氢原子取代形成
dNTP
3’端羟基再次被氢原子取代形成
ddNTP
4
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无论体内还是体外条件下的DNA合成反应,DNA聚合酶都是以单链DNA为模板,根据碱基互补配对原则,将适当的dNTP底物连接到事先已经与DNA单链模板结合的寡核苷酸引物的3’羟基末端,形成3’,5’-磷酸二酯键,同时脱去一个焦磷酸(PPi)分子;而新连接到引物上的dNTP底物又提供一个新的3’羟基末端,与下一个dNTP底物连接,以形成下一个3’,5’-磷酸二酯键,以此类推,从而使引物延伸下去最终合成一条与单链模板互补的完整新链
5
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化学降解法
单侧末端标记的DN***段在5组相互独立的化学反应中分别得到部分降解,其中每一组反应特异地针对某一种或某一类被修饰碱基,因此形成5组带有放射性标记的长短不一的DNA混合物。它们的长度取决于该组反应所针对的碱基在原有DN***段的位置。
通过聚丙烯酰***凝胶电泳分别分离这5组DNA混合物,再通过放射自显影来检测末端标记DNA链的电泳区带位置。
6
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第二代
双脱氧末端终止法操作简便、结果清晰可靠,一次能确定300-500个核苷酸序列,已成为最常用的DNA测序方法。在第二代DNA序列分析的自动化中仍沿用该原理。
化学降解法操作繁杂,所用的化学试剂多为有毒物质,且无法进行自动化分析,故在DNA序列分析中很少人用。
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第二代
80年代中期,出现自动测序仪(应用双脱氧终止法原理)、荧光代替同位素,计算机图象识别
90年代中期,测序仪重大改进、集束化的毛细管电泳代替凝胶电泳
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DNA序列分析的自动化原理
利用双脱氧末端终止法的原理,用四种不同的荧光化合物分别标记4种反应产物,把4种反应物混合在一起进行电泳,从而大大提高点用分析的效率,实现了DNA测序的高度自动化。
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ABI型全自动DNA测序仪:其特点采用专利的4种荧光染料分别标记终止物ddNTP或引物,经Sanger测序反应后,反应产物3’端(标记终止物法)或5’端(标记引物法)带有不同的荧光标记》一个样品的4个测序反应产物可在同一泳道内电泳,从而降低测序泳道间迁移率差异对精确性的影响。通过电泳将各个荧光标记片段分开,同时激光检测器同步扫描,激发的荧光经光栅分光,以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光,并在CCD摄影机上同步成像。电脑可在电泳过程中对仪器运行情况进行同步检测。结果能以电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种方式输出。
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  • 时间2021-02-26