PCRRFLP基因分型方法.pptx

概念
概念
确定基因序列
设计引物
选择内切酶
电 泳
基 因 型
Step by step
基因序列查找
/

/
/
基因序列查找
选择
gene
输入基因名称
基因序列查找
基因的全称
基因的物种来源
引物设计
引物设计
引物一般原则
基本原则：
1. 引物要跟模板紧密结合，
2. 引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在，
3. 引物不能在别的非目的位点引起DNA聚合反应（即错配）。
需要考虑的因素：
引物长度（primer length）、
产物长度（product length）、
序列Tm值(melting temperature)、
ΔG值(internal stability)、
引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin）
错误引发位点（false priming site）、
引物及产物GC 含量（composition）
引物一般原则
引物的长度：15-30bp，常用的是18-27bp
太短：特异性不好 太长：延伸温度大于Taq酶的最适温度
引物末端要求：3’端的序列要比5’端重要，
引物3’端的碱基一般不用A
A在错误引发位点的引发效率相对比较高 ，
5’端序列对PCR 影响不大，常用来引进修饰位点或标物。
引物的GC含量 ：一般为40-60%，以45-55％为宜
两条引物之间的GC含量不宜相差太大
引物一般原则
Tm 值：尽量保证两条引物的Tm值相匹配。最
好相差不要大于5 度
引物二聚体及发夹结构的能量：
最好不要位于3’末端
否则容易产生引物二聚体带而且会降低引物浓度从而导致PCR 正常反应不能进行 ，如果在5’末端对反应就没有多大的影响了
ΔG值: 反映了引物与模板结合的强弱程度。一般情况下，引物的
ΔG值最好呈正弦曲线形状，即5’端和中间ΔG值较高而
3’端ΔG值相对较低，且不要超过9。如此则有利于正确引
发反应而可防止错误引发