半薄超薄切片技术.ppt

半薄/超薄切片技术
半薄超薄切片技术
背景：
肉眼
光学显微镜
透射电镜
分辨率

µm

应用范围
可观察头发丝、双面刀刀刃的厚度
可观察细胞的结构
(最大有效倍数:1000)
可观察细胞内的结构,分辨DNA、蛋白质等生物大分子、单个金属原子（放大倍数可达百万倍）
观察半薄切片
观察超薄切片
半薄超薄切片技术
半薄切片
超薄切片
？
半薄超薄切片技术
一、超薄切片技术介绍
半薄超薄切片技术
固定地好
渗透包埋地好
切地好
载网膜做地好
染地好
超薄切片的基本要求:
半薄超薄切片技术
超薄切片主要步骤
★取材
★固定
★漂洗、脱水
★渗透、包埋
★超薄切片
★超薄切片染色
每一步都是关键,任何环节的疏忽都会导致制片的失败
半薄超薄切片技术
1 取材
取材的基本要求  
(1)动作迅速，取材后快速放入固定液中；
(2)体积要小，一般1㎜3，如果来不及，例如野外取材，也可将组织修成（1×1×2）mm大小长条形，之后再进行分割。
(3)减小损伤，切割器械锋利，操作轻，避免牵拉、挫伤与挤压组织。
(4)低温操作，最好在低温(0℃～4℃)下进行，降低酶的活性。所用器具和固定液都应预冷。
(5)取材部位要准确。
半薄超薄切片技术
取材方法
材料放在洁净的韧性较大的纸上
滴上预冷的固定液
用刀片将组织切下并修小
用牙签或镊子将组织块移至盛有预冷的固定液的小瓶中。
植物材料的取材可以先切成薄片，经适当固定后再切成小方块继续固定。
半薄超薄切片技术
2 固定 (抽气)
 固定的目的
︾ 采用物理、化学等方法迅速杀死细胞的过程称之为固定。
︾ 目的是尽可能使细胞中的各种细胞器以及大分子结构保持生活状态，牢固地固定在它们原来所在的位置上，不发生位移。
︾ 良好的固定是获得精细结构的形态学图象的关键。
半薄超薄切片技术
常用固定剂
(1)四氧化锇 (OsO4)-- OSMIUM TETRAOXIDE
※强氧化剂，与氮原子有较强的亲和力，可较好的固定脂肪、蛋白质、磷酸脂蛋白；
※固定变性DNA及核蛋白，不能固定天然DNA、RNA及糖原；
※具有固定和电子染色双重作用，样品图象反差较好；
▼酶的钝化剂，不适合细胞化学的固定；
▼与乙醇/醛类反应生产沉淀－－漂洗
●分子较大,渗透速度缓慢,但反应迅速,㎜；
●固定时间一般为1-2小时,时间太长易使组织变脆,切片困难；
●锇酸固定液常用浓度：1％－2％;

极易挥发，对粘膜、角膜毒性极大,操作要十分小心!
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