第十节 酶与现代生命科学.ppt

第十一讲酶与现代生命科学
20世纪以来,现代生物科学发展已经日益深入到分子水平,日益深入到以生物大分子结构与功能关系来说明生命现象的本质和规律,现代生命科学的前沿课题如生物信息学、基因组学、结构生物学等无一能离开酶。
一、酶是分子生物学研究的重要工具
二、酶是生命科学研究的重要对象
一、酶是分子生物学研究的重要工具 酶是分子生物学研究的重要工具。特别是限制性核酸内切酶的发现提供了特异剪切DNA的工具,促进了DNA重组技术诞生,推动了基因工程发展,成为分子生物学研究的不可缺少的工具. HindⅡ的识别序列和切割位点 ↓ 5’--- GTPy PU AC –- 3’ 3’--- CAPU Py TG –- 5’ ↑
限制性内切酶在基因工程中的应用
基因工程(ic engineering),也叫基因操作、遗传工程,或重组体DNA技术。它是根据人们预先设想,采用酶学的方法,将目的基因(所需要的基因)重组到一个适宜的载体上组成重组子,再将重组子转化到适当受体细胞中进行扩增表达,以达到改造生物细胞的目的的技术。
基因工程的整个过程由工程菌(细胞)的设计构建和基因产物的生产两大部分组成。前者主要在实验室里进行,其单元操作过程如下:
基因工程的单元操作过程如下:
(1)从供体细胞中分离出基因组DNA,用限制性
核酸内切酶分别将外源DNA(包括外源基因或目的基因)和载体分子切开。
(2)用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片段接到
载体分子上,形成DNA重组分子。
(3)借助于细胞转化手段将DNA重组分子导入受
体细胞中。
(4)短时间培养转化细胞,以扩增DNA重组分子
或使其整含到受体细胞的基因组中。
(5)筛选和鉴定转化细胞,获得使外源基因高
效稳定表达的基因工程菌或细胞。
关于限制性内切酶
Restriction endonueleases
限制性核酸内切酶简称限制性内切酶,是一类能识别双链DNA中特定核苷酸序列并具有专一切割位点的脱氧核糖核酸水解酶。
主要存在于细菌、霉菌中,至今已分离到1000种以上,搞清识别序列的有300种以上。
有关限制性内切酶发现的几个重要实验
50年代初,Luria和Human在研究T4噬菌体感染作用、Bertani和Weigle在研究和P2噬菌体与宿主细胞关系时,发现了细菌内限制与修饰现象。
发现了细菌内存在限制修饰系统,在这两个系统中包括限制酶和修饰酶。限制酶能识别并降解与自身无关的外源DNA,而修饰酶则可通过甲基化修饰自身DNA,免被限制酶降解。
Bertani和Weigle大肠杆菌噬菌体感染实验
Bertani和Weigle在探索和P2噬菌体与宿主细胞关系时,均提出了噬菌体感染大肠杆菌后,宿主细胞对入侵的噬菌体DNA表现有特异的限制作用。
• C



大量繁殖
受到抑制

Meselson和Yuan实验
噬菌体•K12和• C的DNA分别与由K12菌体制备的细胞抽提物保温,并藉蔗糖密度梯度离心观察两种DNA沉降速度的变化。
•K12 DNA
• C DNA
加入K12菌体制备的细胞抽提物
蔗糖密度梯度离心
实验表明,这种限制的本质是宿主细胞K12中存在有能使外来DNA(•CDNA)有限降解的核酸水解酶。
此后,又进一步证实了大肠杆菌K12中的修饰体系即为甲基化酶,该酶修饰了• K12 DNA上的特异部位,使其不被限制体系的酶切割。
结论表明: