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华中科技大学
硕士学位论文
Muts型重组毕赤酵母表达解脂耶氏酵母脂肪酶Lip2的研究
姓名:孙永川
申请学位级别:硕士
专业:生物医学工程
指导教师:闫云君;刘云
2011-05-23
华中科技大学硕士学位论文
摘要
解脂耶氏酵母脂肪酶 Lip2 (YlLip2)具有很高的水解、酯化、转酯活性,在生物
柴油的制备、酯合成以及对映体拆分等领域应用十分广泛。本文构建了 YlLip2 的
Muts 表型重组毕赤酵母(Pichia pastoris)表达菌株,摇瓶发酵筛选高产酶重组子,并研
究了其摇瓶发酵条件,成功进行了 10 L 发酵罐的放大,进一步探讨了混合补料对产
酶的影响。主要研究结果如下:
(1)将实验室构建的载体 pPICZα-lip2,电转化至 P. pastoris KM71H 中,得到
重组菌 KM71H/pPICZα-lip2,所得重组子均为 Muts 表型。
(2)重组子经 YPDS 平板初筛后,转移至罗丹明 B 平板定性筛选,最后用摇瓶
发酵定量筛选高脂肪酶活力的重组子,得到一株最高酶活力达 1,080 U/mL 的 25#重
组子。对 25#重组子进行了发酵条件研究,包括甲醇浓度、pH、诱导时间、装液量、
接种量;并初步研究了混合补料的影响,探讨了其可行性。
(3)进行了 10 L 发酵罐高密度发酵,并与 Mut+表型的发酵条件进行了对比。
Muts 表型在发酵过程中,其参数变化较为稳定。在单独甲醇补加的发酵过程中,其
最高酶活力达 12,000 U/mL,蛋白质含量达 g/L。分别研究了甲醇与甘油、山梨
醇和乳酸混合补料对 YlLip2 生产的影响,甲醇与其它碳源的比例为 2:1。其中,甲
醇与山梨醇混合补料结果最好,酶活力最高达 19,800 U/mL。之后又研究了甲醇与山
梨醇的混合比例对 YlLip2 生产的影响,其中甲醇与山梨醇以 1:1 混合补料的方式最
佳,其酶活力达到了 30,400 U/mL,是甲醇单独补加的 倍,生物量是甲醇单独
补加的 倍,蛋白质含量达 g/L,且发现采用甲醇与山梨醇混合补料时,色
素的产生明显减少,有利于后续的分离纯化。

关键词:脂肪酶 YlLip2 发酵毕赤酵母 Muts表型
I
华中科技大学硕士学位论文
Abstract
The extracellular lipase Lip2 from Yarrowia lipolytic (YlLip2) with high activities of
hydrolysis, esterification and transesterification, has been widely used as a catalyst in
industry for biodiesel production, food process and optical resolution of chiral
compounds. In this work, we constructed a Muts binant Pichia pastoris strain and
selected a highest lipase production clone. Then, the fermentation conditions in shaking
flask and 10L bioreactor were studied. The main work and the results were as follows:
1. binant plasmid pPICZα-lip2 previously constructed in our laboratory was
transformed into P. pastoris KM71H, resulting in a series of Muts strains.
2. After transformation, the transformed cell was spread for growth and selection on
YPDS , the transformants were picked and inoculated on rhodamine B plates
to qualitatively screen high-level lipase expression clones. High-level expression clones
were subseque