第九讲 基因组与比较基因组学研究.ppt

第九讲基因组与比较基因组学研究
一、人工染色体构建
二、新的测序策略--全基因组鸟枪法测序
三、全基因组序列分析--基因组学的新内容
四、parative genomics)
一、人工染色体构建
  1983年,美国的Dana-Farber癌症研究所和哈佛大学医学院的教授首次在Nature上发表文章,报道了构建YAC(Yeast Artificial Chromosome)库的过程。1987年,Burke等人发现,仅仅带有ARS序列的载体虽然能够被复制,但极易在有丝分裂时丢失。即使在选择培养基上,也只有5%-20%的子代细胞带有ARS载体。加入Centromeres (CEN)能显著提高ARS质粒在有丝分裂时的稳定性,90%以上子代细胞带有该载体。CEN还能显著降低拷贝数,从20-50/细胞降为1-2/细胞。(Science, 236:806-812)。
人工染色体含有三种必需成分:着丝粒、端粒和复制起点。
  着丝粒(CEN)位于染色体中央,呈纽扣状结构,在有丝分裂时结合微管并调控染色体的运动,也是姐妹染色单体配对时的最后位点,接收细胞信号而使姐妹染色体分开。
  端粒(TEL):主要功能是防止染色体融合、降解、确保其完整复制。端粒酶以其自身RNA为模板,在染色体端部添加上端粒重复序列,并参与端粒长度和细胞增殖的调控。
  复制起点: DNA复制通常由起始蛋白与特定的DNA序列相互作用开始。DNA合成的起始位点和DNA复制起点(遗传位点)所需的Cis靶区常位于同一段长约100bp的DNA上。
YAC的主要缺点,即一个YAC克隆含有两个本来不相连的独立片段;,在转代培养中可能会发生缺失或重排;,因为YAC与酵母染色体具有相似的结构。。
以细菌寄主系统为基础的克隆载体形成嵌合体的频率较低,转化效率高,又易于分离。科学家用"染色体建造"法用F质粒及其调控基因构建细菌载体,克隆大片段DNA。该质粒主要包括oriS, repE(控制F质粒复制)和parA、 parB(控制拷贝数)等成分。
BAC的优点1. (转化效率比转化酵母高10-100倍);2. 超螺旋环状载体,易于操作;3. F'质粒本身所带的基因控制了质粒的复制;4. 很少发生体内重排。  有人把人类染色体端粒DNA上单个α-卫星DNA单元多聚化形成1Mb左右的大片段并与人类基因组DNA混合,产生了能被复制、能正常分裂并得到长期稳定保存的人工合成的染色体,长度约为6-10Mb,称为MAC或HAC。