鸡蛋白提取液对体外培养干细胞蛋白的影响论文.doc

鸡蛋白提取液对体外培养干细胞蛋白的影响论文.doc鸡蛋白提取液对体外培养干细胞蛋白的影响论文

　　发现一种提取液能促进体细胞向干细胞转变将在再生医学研究中有重要的意义。有文献报道动物的卵细胞提取液能重新编程体细胞，包括猪的卵细胞[1]和非洲爪蟾的卵细胞[2,3]提取液都能使体细胞核重编程。在这个研究中，我们用鸡蛋白提取液作用于不同细胞，共培养 3 d 后，收集细胞，送公司做干细胞蛋白芯片检测，现将研究报道如下。

　　1 材料与方法

　　1. 1 细胞来源 4 种细胞为我们实验室经常培养的细胞，C57 小鼠的骨髓间充质干细胞（ C57-BMSC）（ 自己制备） ,树鼩的脐带间充质干细胞（ TS-UC-MSC） （ 自己制备） ,293T 细胞 （ 购自中国科学院昆明细胞库） 和 GFP 慢病毒转染成功的 293T 细胞（ 293T-GFP） （ 自己转染成功） .

　　1. 2 鸡卵清提取液的制备 取几个鸡卵，无菌分离卵清和卵黄，卵清按 1∶ 1 加裂解液，充分搅匀，存放于 -20℃。冻融 3 次后，离心，取上清，4℃保存。裂解液配方： 50 mmol/L NaCl,5 mmol/L MgCl2,100mmol / L HEPES,pH8. 2,1 mmol / L 二 硫 苏 糖 醇（ DTT） ,0. 1 mmol/L 苯***磺酰***（
PMSF） 和蛋白酶抑制剂。由此得到的提取液为鸡卵清提取液。获得的提取液用 50% 的终浓度与 293T 细胞共培养 3d,然后用定量 PCR 的方法检测细胞多能基因 OCT4和 NANOG 与对照（ 培养基培养） 相比明显升高，即为质控指标合格，可用于下面的实验。

　　1. 3 干细胞蛋白芯片检测步骤 每个芯片孔中加入 100 μl 的 1 × 封闭液，室温摇床上孵育 30 min,避免产生气泡； 抽去封闭液，每个孔中添加 100 μl 样品，一个阵列一个样品； 4 ℃ 振荡过夜孵育。使用Thermo Scientific Wellwash Versa 芯片洗板机清洗玻片，每孔加入 70 μl 生物素标记抗体； 室温震荡孵育1 ~ 2
h,清洗，每孔加入 70 μl 的 1 500 倍稀释的荧光剂-链霉亲和素，用密封条贴住玻片，然后用铝箔纸包住玻片避光室温震荡孵育 1 ~2 ，采用激光扫描仪例如 Axon GenePix 扫描信号。采用芯片分析软件提取数据，对于 Fold change,选取大于1. 5 为有统计学意义。

　　1. 4 Western blot 检测多能标志蛋白 OCT4 和NANOG 兔抗人 OCT4 多克隆抗体购自 Immunoa-way 公司，鼠抗人 NANOG 单克隆抗体购自 Millipore公司，二抗均购自碧云天生物技术有限公司。293T细胞在 6 孔板中，一孔加培养基，一孔加 50% 终浓度的鸡蛋白提取液，共培养 3 d 后，用碧云天的 IP细胞裂解液提细胞蛋白，取 50
μl 细胞蛋白液加 10μl 6 × 的上样缓冲液，100℃ 水浴 5 min,上样 20 μl,进行 SDS-PAGE 电泳，电泳结束后，100 v 电压转膜1 h,膜用 5% 脱脂奶粉的 TBS 封闭 37℃ 1 h,将一抗1∶ 250 稀释于 2% 脱脂奶粉的 TBS 中，3