双向电泳原理及实验步骤.pptx

1994年，澳大利亚Macquarie大学的Wilkins和Williams首先提出了蛋白质组（Proteome）的概念，其定义为在一种细胞内存在的全部蛋白质。
蛋白质组研究中主要应用的技术包括：双相电泳(2-DE)、新型质谱(MS)技术、数据库设置与检索系统等。
蛋白质组分析的首要要求
将来自于全细胞、组织或生物体中所包含的多达几千种混合蛋白质进行分离、检测和分析 。
2-DE技术依然是大多数蛋白质组研究中分离复杂蛋白质混合物的首选技术 。
生物学问题的提出
实验模型的设计
实验组和对照组样品的制备
蛋白样品的IEF和PAGE电泳分离
图像扫描和初步分析
感兴趣蛋白点的切取
胰酶对脱色后蛋白质的消化
质谱的多肽指纹图、微测序分析
质谱结果的生物信息学分析和比对
新蛋白质的发现
其它实验的进一步验证
蛋白信息的初步获得
蛋白质组研究的基本技术路线
蛋白质样品的制备
双向电泳
图像分析
转印至膜上的蛋白
凝胶中的蛋白
溶液中的蛋白
混合肽
蛋白质质量
N端测序
肽序列质谱数据
肽指纹图
数据搜索
新的或已知蛋白
蛋白转录后修饰的鉴定
一、双向电泳的实验原理
+
–
pH 3
pH
pH 10
+
–
pH 3
pH
pH 10
+
–
pH 3
pH
pH 10
+
–
pH 3
pH
pH 10
第一向：等电聚焦
一维固相pH梯度等电聚焦（IEF with IPG）：
IPG胶的材料是Immobilines，为拥有CH2=CH-CO-NH-R结构的8种丙烯酰***衍生物系列，其中R包含羧基或叔氨基团，它们构成了分布在pH3-10不同值的缓冲体系。根据公布的配方计算后，将适宜的IPG试剂添加至混合物中用于凝胶聚合，在聚合中缓冲基团通过乙烯键共价聚合至聚丙烯酰***骨架中而形成pH梯度。通过这种方式生成的IPG不会发生电渗透作用，因而可以进行特别稳定的IEF分离达到真正的平衡状态。
–
charge
size
第二向：SDS-PAGE电泳
Proteins migrate through the gel at a rate proportional to their size.
Smallest proteins travel the furthest distance
+
pH 3
pH
pH10
样品制备基本原则
使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白），制备方法应具有可重现性。
防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。
防止在样品制备过程中发生样品抽提后的化学修饰（如酶性或化学性降解等）。
完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。
尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。
样品制备
细胞样品：反复冻融、超声破碎
组织样品：碾磨、匀浆
植物样品：碾磨
分泌蛋白
蛋白质样品的浓缩、去除滤液中的高丰度蛋白
菌体蛋白
裂解液处理、超声破碎