454测序.doc

第二代测序技术( Next-Generation Sequencing ) NGS 之基础篇 2001 年,美、英、法、德、日、中六国合作,历时十年,耗资数十亿美元的人类基因组计划( Human Genome Project ,HGP )宣告完成。转眼又是十年过去,在此期间,各国科学家仍在为解读基因的密码而不懈努力,这其中最大的突破,就是第二代测序技术的推出。HGP 的顺利完成证明了我们有能力对自身的遗传信息进行研究,然而,高昂的成本、漫长的时间、巨大的人力需求,无不限制着对遗传密码的进一步认识。从HGP 开始的第一天期,科学家们就在寻求更好的方法来对基因组进行研究, “鸟枪法”就是其中之一。 2006 年,美国 X 大奖基金会( )设立了奖金高达 1000 万美元的基因组 Archon X大奖, 旨在奖励第一个在 10 天内以低于 100 万美元的成本完成 100 个人类基因组测序的民间团队。而罗氏( Roche )、应用生物系统( Applied Biosystems ,ABI )、 Illumina 三家公司先后推出了各自的第二代高通量测序平台,成为 NGS 领域的领头羊。 2005 年底,454 公司推出第一个基于焦磷酸测序原理的高通量基因组测序系统—— Genome Sequencer 20System ,这是核酸测序技术发展史上里程碑式的事件。随后,罗氏公司以 亿美元收购了 454 公司,并在 2006 年推出了更新的GSFLX 测序系统,该系统可在 10小时的运行中获得 100 万条读长(reads ), 4~6 亿个碱基信息( base pair ),且准确率达到 99% 以上。 2008 年, GSFLX 系统再次升级,通量提高了 5 倍,读长和准确率也有所增加。虽然 454 GS 测序平台也许不是市场占有率最高的测序仪,但截至 2011 年3 月,利用该系统进行研究的论文已发表超过 1000 余篇,而它在读长上的优势明显胜于另两套系统,因此在从头测序( denovo )和宏基因组测序( meta genome )方面有着不可替代的地位。 2006 年, Solexa 公司也推出了自己的 NGS 系统—— Genome Analyzer ,简称GA 。这套基于 DNA 簇( DNA cluster )、桥式 PCR (Bridge PCR )和可逆阻断(Reversible terminator )等核心技术的系统具有高通量、低错误率、低成本、应用范围广等优点。 2007 年, Illumina 公司以 6亿美元的高价收购了 Solexa , 使GA 得以商品化。 GA 最早期的版本一次运行可获得 1Gb 的数据,因此也有 1Gb Analyzer 的含义,而最新的 Hiseq2000 平台则能够在 10天的运行中获得 300G b 以上的数据,读取的碱基长度达到 150bp 左右。更有消息称, Illumina 已完成了600Gb 的运行测试并在部分客户中开展了前期体验, Tb(1000Gb )级的测试 Run 也将于年内进行。据不完全统计,Illumina 公司已售出超过 600 台/套GAIIx 和Hiseq2000 平台, 2010 年仅深圳华大基因研究院一家就购买了 128 台 Hiseq2000 ,一举成为全球最大的基因组测序与分析中心,Illumina 公司在测序领域的影响力由此可见一斑。在Sanger 测序时代,美国应用生物系统公司(ABI )一直是该行业的龙头老大,其垄断地位无人能撼,从早期的 377 到全自动化的 3730xl ,ABI 的测序仪被广泛应用在基因组学研究的各个方面。然而在第二代测序技术迅猛发展之初, ABI 起步较晚,显得有些漫不经心。直到 2005 年454 公司推出 GS 平台, ABI 的领先地位受到威胁,这才开始发力,迅速收购了研发 NGS 的一家小公司 Agencourt ,并于 2007 年推出了它的 SOLiD 测序平台。此后 SOLiD 不断升级,目前已到 SOLiD 5 版本( SOLiD 5500xl )。 SOLiD 的全称是 Sequencing byOligo Ligation Detection ,即寡聚物连接检测测序,其基本原理是通过荧光标记的 8 碱基单链 DNA 探针与模板配对连接,发出不同的荧光信号,从而读取目标序列的碱基排列顺序。在该方法下,目标序列的所有碱基都被读取了两遍,因此 SOLi D 最大的优势就是它的高准确率。据悉,SOLiD 5平台的测序通量已达到 30Gb/ 天, 成本低于 60美元/Gb ,准确率高达 % 。并且由于 SOLiD 系统采用的不是 PCR 反应进行 DNA 合成与测序,因此对于高 GC