重组大肠杆菌dna聚合酶提取及纯化研究论文.pdf

浙江大学
硕士学位论文
重组大肠杆菌DNA聚合酶的提取及纯化研究
姓名:孙章辉
申请学位级别:硕士
专业:生物化工
指导教师:蔡谨
20060301
摘要欠肿由镅е凶钪匾5墓ぞ咧弧T赑技术中,酆厦钙鹱关键饔谩转化大肠杆菌甘谴邮热雀司蟹掷氪炕玫降牡谝桓鲇糜赑的热稳定性酆厦浮妇哂’一馇忻富钚裕潜U娑茸罡叩腄聚合酶之一。本文主要研究从重组工程菌中分别提取酆厦讣癟聚合酶。以重组表达质粒;拗骶鶨阨,获得转化子。利用的热稳定性,将破胞液在。缓笥昧蛩犸С恋矸ɑ竦么炕谋泶锏白。对重组甤呐嘌跫杏呕呕嘌跫#,的终浓度为疞,诱导培养时间为,诱导培养温度为。T谟呕跫拢⒔鸵嚎傻单位的聚合酶,比活可达,/蛋白质。。在傅拇炕讨校溶菌酶裂解细胞,利用傅娜任榷ㄐ裕捎萌缺湫苑冻融法ゾ蟛分杂质蛋白,得到复秩芤骸H缓蟪⑹允褂昧姿嵯宋豍等几种离子交换树脂,及葡聚糖凝胶、燃钢帜菏髦唇徊酱化浮Q芯坑梦薅炯哿娜樘谴鍵饔盏技粒⒍杂盏继跫辛擞化,优化条件为:培养液接种后立即加入疞的乳糖,诱导培养笫栈窬体。用优化后的培养条件及纯化技术,在实验室环境中制备重组酆酶。将破胞液在。缓笠来喂齁离子交换柱和凝胶柱得到纯化浮T赑扩增实验中,纯化产品具有与商品酶类似的活性和扩增效果,从嘌褐泄驳玫木酆厦福炕疨酶比活达关键词:福琍酶,酆厦福琍,乳糖诱导,炕用猄到,痬ǘ任/浙江大学硕士学位论文一、,、、
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第一章绪论际踅樯脑┰鍪笛榈奶跫际踉谏蒲е邢破鹆艘怀「锩梢允谷嗣峭ü父鲂∈钡氖从甏衅诜⒄蛊鹄吹奶逋夂怂扩增技术。它的目的是使得显诙淌奔淠谘杆倮┰觯哂刑匾欤舾校产率高,快速,简便,重复性好,易于自动化等突出优点,使它在分子生物学和医学领域迅速得到了广泛的实际应用。被许多科学家视为近几十年来分子生物学领域最重要的一项技术突破‘】。管内的酆戏从Γ涂山獶扩增丁Mü齈技术不仅可以扩增存在于样品中的部梢愿患旌螪分子中的任一种。闹匾<值在于扩增存在微量而特殊的蛄小U庀罴际跏怯蒏于年发明的,为此他获得了年的诺贝尔化学奖‘縖。陌氡A舾粗剖巧锝痛ù闹匾M揪丁K碊在多种酶的作用下可以变性解链成单链,在酆厦赣肫舳拥牟斡胂拢菁罨ゲ古对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现,诟呶率币部梢苑⑸性解链,当温度降低后又可以复性成为双链。因此,通过温度变化控制变性和复性,并设计引物做启动子,加入酆厦浮涂梢酝瓿商囟基因的体外复制‘标准的谭治H剑瓺变性ぁ:双链0逶谌茸饔孟拢氢键断裂,形成单链嘶·~·合低澄露冉档停镉隓模板结合,形成局部双链。由·~·涸谀腿刃訢聚合酶ぷ笥易罴训幕钚的作用下,以T希右锏·端·
的报道NA巳范ㄗ罴雅ǘ龋梢杂胦。鱫疞的递增浓度的进行预备实验,选出最适的浓度。在从旌衔镏校×考跎儆懈吲ǘ鹊拇旱从Σ问U活性。使用带有疦馇泻怂崦富钚缘娜任榷ň酆厦缚梢蕴岣弑U娑取,这样可减少聚合酶在低的序列,可适当提高变性温度。但变陛温度过高或时间过长都会导致酶活性的损引物的浓度会影响特异性。最佳的引物浓度一般在到=细叩囊物浓度会导致非特异性产物扩增。酆厦傅难≡酆厦副豢醋鍪堑捅U娑鹊木酆厦福蛭F淙鄙’到馇泻怂崦但是这些聚合酶的产量篖酆厦傅汀8弑U婷赋齌腅瓵以外,一般都都不会在思覣尾巴蛭F’.馇忻富钚,所以做克隆的时候需要扩增完了后再加普通ゼ痈鯝。另外将酆厦竿’到外切核酸酶活性第二种聚合酶混合在一起可以获得比单独酆厦父叩保真度,并可以得到高产量及扩增长模板。镁离子影响亩喔龇矫妫瓾酆厦傅幕钚裕饣嵊跋觳浚辉偃缫物退火,这会影响特异性。和模板同镁离子结合,降低了酶活性所需要的游离镁离子的量。最佳的镁离子浓度对于不同的引物对和模板都不同,。在多数情况下,较高的游离镁离子浓度可以增加产量,但也会增加非特异性扩增,降低忠实性比唬灿邢喾荷的基团,例如磷酸基团或等可能影响胱优ǘ鹊奈镏剩员Vぷ钍高浓度的岫岳┰龇从ζ鹨种谱饔谩=恐謉呐ǘ却降低到—梢允估┰霾锘竦寐獾牟省标准浓度为/—浅V匾#墒鼓0耆ń饬矗缓蠹尤肽腿刃訢聚合酶温下仍有活性从而延伸非特异性。配对的引物与模板复合物所造成的错误,变性不完全,往往使О埽蛭N幢湫酝耆ǖ腄双链会很快复性,减少产量。一般变性温度与时间为·。在变性温度下双链饬粗恍杓该钟即可完全,所耗时间主要是为使反应体系完全达到适当的温度。对于富含甅ǘ浓度。/.失。浙江大学硕士学位论文甦甂
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