人215kDa MBP基因对神经及相关细胞增殖与凋亡作用研究.pdf

四川大学
博士学位论文
MBP基因对神经及相关细胞增殖与凋亡作用的研究
姓名:刘戟
申请学位级别:博士
专业:生物化学与分子生物学
指导教师:陈俊杰
20040428
四川大学博士学位论文
人基因对神经及相关细胞
增殖与凋亡作用的研究
中文摘要
博士生刘戟
导师陈俊杰教授
人髓鞘碱性蛋白是神经
组织特有的蛋白质,由中枢神经系统少突胶质细胞和外周
神经系统雪旺氏细胞合成,占髓鞘蛋白质总量的
在神经纤维的绝缘和快速传导中发挥重要作用。具有种属、
组织细胞特异性和时空表达阶段特异性,对人脑发育、神经细
胞分化、髓鞘发生与髓鞘形成具有重要生理作用。不仅存
在于神经组织,而且广泛分布于造血系统,其功能更为广泛。
在神经科学领域中,及其基因的研究起步早、进展快,迄
今仍是人们关注的焦点之一。在神经细胞的生长、发育和
分化过程中究竟是促进细胞生长、增殖或是抑制生长、诱导细
胞凋亡这方面的有关研究报道目前国内外尚存争议。弄清楚
对细胞增殖和凋亡的确切作用,不仅对人脑发育、神经细
胞分化、髓鞘发生与髓鞘形成等基础研究具有重要意义,而且
对疾病发病机理与诊治等临床研究无疑具有广泛应用价
值。本课题在本实验室系列研究的基础上,应用我室构建的含
人型胶原基因调节元件基因,经脂质体
介导转染大鼠皮质神经元细胞、大鼠骨髓基质干细胞和人神经
星形胶质瘤细胞,同时转染含入神经生长因子
和人脑源性神经营养因子的基因
的细胞为阳性对照,转染空载体
的细胞为阴性对照。通过细胞形态和微结构改变
的观察、增殖曲线测定、检测、流式细胞分析、
琼脂糖电泳、免疫细胞化学分析、免疫斑点杂交、杂交
和原位杂交等多种方法,从细胞与分子水平观察和研究
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了和等基因神经及相关细胞中表达及其对细
胞增殖和凋亡的影响。
实验结果证明基因分别在神经元细胞、
骨髓基质千细胞和人神经星形胶质瘤细胞中成功表达,
表达产物具特异抗原活性。法研究显示,
以及和对神经元细胞、骨髓基质干细胞和人
神经星形胶质瘤细胞三种细胞的增殖均有明显的促进
作用,与空载体转染对照组细胞相比,和
转染细胞具有明显的抗凋亡作用。染色显示,
及基因转染细胞经相同浓度
处理后,其细胞形态结构无明显改变。电子显微镜观察显示,
相同浓度和时间处理的及微基因
转染细胞的超微结构未见明显凋亡改变。琼脂糖电泳显示
处理的空载体对照组显现出细胞凋亡所特有的阶梯
状条带,而及基因
转染组细胞的琼脂糖电泳图谱未见
原位荧光标记显示,正常对照组细胞由于核内末降解,因
此不会被荧光物标记,细胞核显淡绿色处理的空载体转
染组细胞发生凋亡、分子大量缺刻或断裂,端游离一
基被荧光物标记,细胞核呈棕黄色处理的
及基因转染组细胞绝大多数与正常对照组相似,
细胞核显淡绿色,仅少数个别细胞被标记成淡黄色。流式细胞
仪分析显示, 未处理的细胞其自然凋亡率平均为
空载体对照组转染神经元细胞、骨髓基质干细胞和人神经星形
胶质瘤细胞〔处理后,其细胞凋亡率显著升高,相
同处理的基因转染细胞其细胞凋亡率不足空载体
转染组的三分之一。和免疫组化法初步证实空载
体对照组转染神经元细胞、骨髓基质干细胞和人神经星形胶质
瘤细胞处理后,其细胞和表达显
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著升高,相同处理的基因转染细胞其细胞和
表达则无明显改变。
以上实验证实本室构建的
基因含有相应的目的
基因插入片段,经彭转染、
筛选分别获得了含目的基因的神经元细胞、骨髓基质干细胞和
人神经星形胶质瘤细胞并使目的基因
和分别以上细胞中成功获得表达。对于处理
神经元细胞、骨髓基质干细胞和人神经星形胶质瘤细胞
与和一样能显著抑制
处理对细胞的凋亡诱导、促进细胞增殖。在我室构建的基
因基础上,上述实验首次证实基因能有效在体
外培养的神经元细胞、骨髓基质干细胞和人神经星形胶质瘤细
胞中表达并具有显著促进细胞生长、增殖和抑制细
胞凋亡的作用进一步为陈俊杰教授提出“可能
在人脑的早期发育阶段具有促进脑生长发育、细胞增殖的生理
作用”的假设和我室报道的含第二外显子的早在
第周胎龄人脑脊髓前角和延脑第四脑室底的神经元前体细胞
中开始表达的现象提供了相关的证据。
关键词细胞增殖细胞凋亡神经元细胞
骨髓基质千细胞
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