吸水链霉菌5008中井冈霉素生物合成机理研究.pdf

上海交通大学
博士学位论文
吸水链霉菌5008中井冈霉素生物合成机理的研究
姓名:李磊
申请学位级别:博士
专业:微生物学
指导教师:邓子新
20080501
吸水链霉菌中井冈霉素生物合成机理的研究摘要是年从我国井冈山分离得到的吸水链霉菌的一个亚种,它产生的井冈霉素是一类水溶性的氨基糖苷类抗生素,在防治水稻纹枯病上已得到广泛应用。目前井冈霉素的生物合成基因簇已被成功克隆并测序,通过对测序结果的分析可以帮助我们对井冈霉素的生物合成机理进行更深入的研究。通过对基因簇的生物信息学分析,基因编码的蛋白与大肠杆菌中的软骨素聚合酶有高度的同源性,的功能是催化软骨素骨架的聚合。含有霭被幔菿个氨基酸少觯挥赩撕个氨基酸残基的区域是糖基配体的结合区,与糖基转移酶非常相似。另外,中一个保守的模块和两个?,据此我们推测可能参与井冈霉素生物合成过程中最后一步的糖基转移反应。将基因中断后,检测发现井冈霉素的特征峰消失,同时的前体物质有效氧***大量累积,用带有红霉素强启动子的高拷贝载体将回补后,井冈霉素的产生得到恢复,由此证明基因确实编码一个糖基转移酶,而且该糖基转移反应为井冈霉素生物合成的限速步骤。将在大肠杆菌中异源表达得到可溶性蛋白后,合作单位美国俄勒冈吸水链霉菌井冈变种上海交通大学博士学位论文甦
具有%的一致性和%的相似性。它们的功能是在一的帮助下协同运教授的实验室做了体外的相关实验,进一步证实了基因编码的糖基转移酶的功能,并通过笛橹っ鱑一葡萄糖和黄咸烟嵌伎梢员桓妹咐茫ū冉隙訳一葡萄糖为该糖基转移酶的最适底物。姿岷T逄呛铣擅窻有高度的同源性,另外与大肠杆菌中的蛋白也有一定的同源性。在大肠杆菌中,,期间有供体糖基的空间异构过程。通过基因置换实验得到的突变株型觳獠坏骄悦顾氐牟S么泻烀顾厍科舳拥恼型载体将回补后,井冈霉素的生物合成得到恢复,由此证明是井冈霉素生物合成的必需基因。推测其编码的蛋白负责有效***的反应。基因诱导产生的蛋白与菌株&、葡萄糖或半乳糖。用个蛋白中有个跨膜区,属于主要异化超家族。/幕蛑没煌槐渲闘中仍可检测到井冈霉素的产生,但是产量有所下降。转运蛋白的功能可能有两方面,一方面可以将胞外的黄咸烟亲T酥涟冢ü黾犹腔R泼傅牡孜镆蕴岣井冈霉素的产量。另外一方面它也可以将胞内合成的井冈霉素转运到胞州立大学由基因编码的蛋白则与来自的与有效烯***
外,降低胞内井冈霉素的含量即等于减少糖基转移酶酶促反应的产物,从而诱导酶促反应向合成井冈霉素的方向进行。同时降低胞内井冈霉素的含量也是细胞自我保护的一种机制。吸水链霉菌的正常生长温度为℃,但其实验中的发酵温度为℃,工业生产上甚至达到℃,在发酵温度下井冈霉素的产量提高近十倍。通过实验可知井冈霉素生物合成结构基因分为霾纵子:、蛌,霾僮葑拥拇砘騰瑅在。淖B***蕉济飨愿哂妗Mü镄畔⒀Х治觯颐在井冈霉素生物合成基因簇中找到两个编码双组分调节系统的基因和,并对它们分别做了单基因置换和双基因置换。检测所得龅セ蛑没煌槐渲闘、退ɑ蛑没煌槐渲闘在。姆酵液,井冈霉素产量均下降约%,用带有红霉素强启动子的整合型载体将基因对应回补后井冈霉素的产量恢复到接近野生型水平。转录方面,鐾槐渲曛械慕峁够蛟娴淖B***蕉冀弦吧兔飨越档汀S纱可知基因和确实参与了井冈霉素的温度调节。分析推测,蛋白为一个组氨酸激酶,接受胞外信号后对其保守的组氨酸残基自体磷酸化,从而自体激活,然后不需要进一步使用涂梢越姿峄传递到应答调节蛋白的天门冬氨酸残基上,磷酸化的作用于目的基因的危佣銮磕康幕虻淖B肌>悦顾夭渴芪露调控的现象非常特别,目前还没有关于抗生素产量受温度调控的报道。关键词:吸水链霉菌,井冈霉素,有效霉素,氨基糖苷类抗生素,温度调节上海交通大学博士学位论文吸水链霉菌中井冈霉素生物合成机理的研究
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符号说明‘覲曲阿泊拉霉素抗性基因肛内酰***酶基因,编码氨***霉素酰基转移酶基因,编码***霉素抗性基因入噬菌体包装位点蜒鹾烀鼓邗合酶二***