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寡核苷酸图谱分析.docx


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寡核苷酸图谱分析.docx
文档介绍:
寡核甘酸图谱分析是指核酸或核酸片段经 T1核酸酶切割后电泳,少数较大分子量的酶切核 酸片段在聚丙烯酰***凝胶上分布特点的比较。因为它是通过少数核酸片段来了解整个核酸的特征, 如同根据指纹特点判断案情一样,因此又称为指纹图分析 (Analysis of fingerprint map) 。该法
最大优点为比较简便,敏感性高,能显示出核酸间细小的差别,但缺点是无法对差别大的两条来源 不同的核酸进行比较。目前该种方法已在病毒学研究中得到了广泛的应用, 特别是对RNAW毒分类、
鉴定病毒遗传变异等,在流行病学调查中具有重要意义。
(一)原理 提纯后的病毒核酸,通过适当的酶切,可产生大小不同的片段,经放射性同位素标记(或 在病毒培养时标记)后,进行垂直双相电泳,再经放射自显影,可得到特征性的图谱,即寡核甘酸 指纹图谱。所用的酶一般是T1核糖核酸酶,这种酶是一种 RNA艮制酶,特异性地作用于鸟喋吟核 甘酸的3'磷酸基团,切割与其邻近核甘酸相连的 5'磷酯键,最终产物为带 3'磷酸鸟喋吟末端
的寡核甘酸,即每断片的3'末端为鸟喋吟并带有磷酸,而5'末端就暴露出羟基团。然后在 T4多 核甘酸激酶的作用下,用32P-ATP标记寡核甘酸的5'末端,最后用饱和酚和酵母 RNA昆合液终 止激酶的作用。在pH3.5条件下,从上到下进行第一相电泳,依片段所带电荷的不同将其分开,其 后在pH8.2条件下,从右到左进行第二相电泳,可根据片段长短的不同将其分开,通过自显影,便 可在底片上看到片段的位置和数目,借此对不同的病毒株的核酸进行分析比较。 在电泳中一般采
用两种指示剂:一种为澳酚蓝(BPB),它的大小相当于8-10个核甘酸,在pH3.5时呈绿色,在pH8.2 时呈蓝色;另一种为联苯***(Xylene Cyanol ,简称XC),其大小相当于25个核甘酸,在pH3.5时 为蓝色,pH8.2时为绿色,它周围的点为重点观察区。由于 12-14个碱基以上的核甘酸片段特异性 高,太短的片段特异性低,因此,图谱上部的斑点由于片段较小难以进行分析,多取图谱下端或整 个图的下1/3处斑点进行比较,一般取50-70个斑点。
(二)基本方法
.病毒的增殖与核酸的提纯 用适当的组织培养细胞繁殖病毒,有些病毒也可用鸡胚进行繁殖,以
饱和酚法提纯病毒核酸。
.核糖核酸酶切和同位素标记 常用的酶是T1核糖核酸酶(故该技术又称为T1-寡核甘酸指纹图
谱),将该酶与病毒RNA以一定比例混合,置37c消化30-40分钟。经消化后的核酸变为大小不等 的片段,片段的大小与鸟甘酸的含量有关。消化步骤为:于 Eppendorf管中加入1?l去离子水,加 1?g 病毒 RNA 加 1?l 2 倍浓缩的消化缓冲液(40m mol/L pH7.5 Tris-HCl , 2m mol/L EDTA),置 沸水中煮60-90秒,快速置冰浴中冷却,加入2?l T1酶(5IU/?l),混合后置37c水浴30-40分钟。 标记的方法有两种:一是内标记,即在病毒培养液中加入 32P—正磷酸盐或32P-ATP,使增殖的病

毒中带有32P。另一种方法是外标记(又称末端标记),在经过消化后的核酸片段中加入 32P-ATP和 T4多核甘酸激酶,以标记片段 5'端。外标记方法为:于上述酶消化溶液中加入 35?l激酶
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