SSR技术原理方法及步骤.docx

SSR技术原理方法及步骤.docxSSR技术原理-方法及步骤
SSR技术
1. SSR简介
说明：简单重复序列(Simple Sequence Repeat，SSR)，简单重复序(SSR)也称微卫星DNA，其串联重复的核心序列为1-6 bp，其中最常见是双核苷酸重复，即(CA) n和(TG) n每个微卫星DNA的核心序列结构相同，重复单位数目10-60个，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。
SSR标记的基本原理：根据微卫星序列两端互补序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段，由于核心序列串联重复数目不同，因而能够用PCR的方法扩增出不同长度的PCR产物，将扩增产物进行凝胶电泳，根据分离片段的大小决定基因型并计算等位基因频率。在真核生物中，存在许多2-5bp简单重复序列，称为“微卫星DNA”其两端的序列高度保守，可设计双引物进行PCR扩增，揭示其多态性。
SSR具有以下一些优点：(l)一般检测到的是一个单一的多等位基因位点；(2)微卫星呈共显性遗传，故可鉴别杂合子和纯合子；(3)所需DNA量少。显然，在采用SSR技术分析微卫星DNA
多态性时必须知道重复序列两端的DNA序列的信息。如不能直接从DNA数据库查寻则首先必须对其进行测序。
SSR的分类：根据SSR核心序列排列方式的不同，可分为3种类型：1）完全型(perfect)，指核心序列以不间断的重复方式首尾相连构成的DNA。如： ATATATATATATATATATATATATATATATATAT；2）不完全型(imperfect)，指在SSR的核心序列之间有3个以下的非重复碱基,但两端的连续重复核心序列重复数大于3 。如：ATATATATGGATATATATATCGATATATATATATATATGGATATATATAT；3）　　复合型(compound) ，指2个或2个以上的串联核心序列由3个或3个以上的连续的非重复碱基分隔开,但这种连续性的核心序列重复数不少于5 。如：ATATATATATATATGGGATATATATATATA 。3种类型中完全型是SSR标记中应用较多的一种类型。
SSR在植物基因组中的分布：SSR广泛分布于各种真核生物的基因组中，大约每隔10～
50kb就存在一个SSR。哺乳动物中的SSR的数量大约为植物中的5～6倍。在植物中，；双子叶植物中的SSR数量大于单子叶植物，，；核DNA中的SSR数量多于细胞质DNA中的SSR，绝大多数单碱基重复型及2碱基重复型SSR存在于非编码区，3碱基重复型多位于编码区。
微卫星的利用价值：由于核心序列重复数的不同，等位的SSR位点可呈现出多态性（SSLP，simple sequence length polymorphism）。大多表现为共显性遗传，有的表现为显性遗传。由于SSR DNA两侧序列（离开20bp以上）表现出保守特征，所以可设计出上下游PCR引物，扩增出包含SSR的DNA序列。微卫星分析常用于：遗传图谱构建；种质鉴定；遗传多样性分析；标记辅助选择（MAS，marker- assistant seletion，marker- aided seletion）；基因定位；数量性状基因座（QTL）分析；系谱分析；亲源关系鉴定等。
SSR引物的来源：借鉴其他近缘种序列。1）通过筛选文库、测序开发自己的SSR引物。 　　
2）通过核酸数据库查询，从已有序列中搜寻包括SSR的序列并设计引物。
SSR分析实验的主要技术环节：提取DNA；PCR扩增；电泳及显色；电泳胶板带型的照相、记录；数据分析处理。其中，PCR产物分离的电泳方法主要有：高浓度琼脂糖电泳（4%胶只能分辨4-6bp差异）；变性聚丙烯酰***序列胶电泳；非变性聚丙烯酰***凝胶电泳。 　　由于扩增的片段短(一般小于300bp)，基因间的差异小(一般为几个bp)，故通常使用分辨率高的聚丙烯酰***凝胶电泳。在程序上，变性胶虽然比非变性胶麻烦些，但考虑到在非变性胶上会出现人为假象—异源双链分子，比如导致SSR杂合子中出现3-4条带，而不是正常的2条带，从而干扰等位位点统计，因此我们建议在SSR分析中均采用变性胶电泳。
2. ISSR分子标记的实验原理及操作流程
原理：ISSR（inter-simple sequence repeat）标记是一种类似RAPD，但利用包含重复序列并在3’或5’锚定的单寡聚核酸引物对基因组进行扩增的标记系统，即用SSR引物来扩增重复序列之间的区域。其原理具体是，ISSR标记根据
生物广泛存在SSR的特点，利用在生物基因组常出现的SSR本身设计引物，无需预先克隆和测序。用于扩增的引物一般为16-18个碱基序列，由1-4个碱基组成的串联重