软琼脂集落形成实验.doc

给你找了几个试验方法: 1. 双层软琼脂集落形成率实验于 24 孔板中, 下层低熔点琼脂浓度为 %, 上层为 0. 33 %, 每孔上层低熔点琼脂含细胞数为 2 000 个, 每种细胞共铺 5孔。把培养板移入 CO2 孵箱,在 37 ℃、 5 %CO2 及饱和湿度环境下培养 2~ 3 周后倒置显微镜下计数直径大于 100 μ m 或含 50 个细胞以上的克隆, 并计算克隆形成率( 克隆形成数/ 接种细胞数× 100 %= 克隆形成率)。 2. 软琼脂克隆形成实验将 p27Kip 1 转染组、空载体转染组和未转染组细胞以每组 60 0 个细胞接种于 60 mm 含底层 5 g/L 琼脂糖和顶层 3 g/L 琼脂糖的软琼脂中;37 ℃培养箱中培养 14 d; 倒置显微镜下观察克隆形成情况. 计算克隆形成率. 软琼脂克隆形成率= 克隆数/ 接种细胞数× 100% 对照组克隆数- 实验组克隆数抑制率=× 100% 对照组克隆数 3. 软琼脂克隆形成实验用去离子水配制 7g. L-1 和 12 g. L -1 琼脂溶液, 高温高压灭菌后,于 45 ℃水浴保温备用. 配制 2× DMEM 培养液, 高温高压灭菌后 45 ℃ 2× DMEM 与 12 g. L-1 琼脂溶液等体积混匀后,按 1 mL/ 孔加入 24 孔培养板, 4℃放置 30 min 使之凝固. 再将 2× DMEM 与 7g. L-1 琼脂溶液等体积混匀, 之后加入单细胞悬液并调整细胞终浓度为 1× 106 个. L-1 , 此混悬液按每孔 mL 加入上述 24 孔板,铺平后室温放置使琼脂凝固,之后置于 37 ℃, 50 mL . L-1 CO2 孵箱中培养 2 wk ,观察细胞克隆形成情况并计算克隆形成率. 同时设 HO-8910 为空白对照和 8910-pcDNA3 为空载体对照. 4. 软琼脂克隆形成试验细胞在 35 mm 的平皿中长至 70 %~ 80 %铺满,然后与 20 μμ mol · I-1 的 AS - ODN 。共孵育 4h , 之后将细胞重悬于新鲜培养液配制 6mL · L-1 的底层琼脂, lml /孔加入 24 孔板中, 调整细胞浓度并与 4 mL · L-1 的琼脂混合, 以每孔 mL 中含 500 个细胞加到底层琼脂上,置 37 ℃培养 2Wk 后计数克隆形成数克隆大于 100 个细胞着计数。可以用不同密度细胞绘制标准曲线后测细胞密度, 也可直接用 OD 值绘制生长曲线, MTT 法具体步骤如下: MTT 比色试验: A.[ 概述] 四唑盐比色试验是一种检测细胞存活和生长的方法. 试验所用的显色剂是一种能接受氢原子的染料, 化学名 3-(4,5- 二***噻唑-2)-2,5- 二苯基四氮唑嗅盐, 商品名是噻唑蓝, 简称为 MTT 。检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的 MTT 还原为难溶性的蓝紫色结晶物 formazan 并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。二***亚砜( DMSO ) 能溶解细胞中的 formazan , 用酶联免疫检测仪在 490nm 波长处测定起光吸收值, 可间接反映活细胞量。在一定细胞数范围内, MTT 结晶物形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、