3_5-二硝基水杨酸定糖法.ppt

植物总糖、还原糖的提取鉴定及其含量测定 3,5- 二硝基水杨酸定糖法实验目的 1掌握还原糖和总糖测定的基本原理 2学习比色法测定还原糖的操作方法 3学习分光光度法测定的原理和方法实验原理 还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类, 单糖都是还原糖,双糖和多糖不一定是还原糖,其中乳糖和麦芽糖是还原糖,蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶解度不同,可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来,对没有还原性的双糖和多糖,可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定,再分别求出样品中还原糖和总糖的含量(还原糖以葡萄糖含量计)。 还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物, 3,5- 二硝基水杨酸则被还原为棕红色的 3-氨基-5- 硝基水杨酸。在一定范围内,还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系,利用分光光度计,在 520 nm 波长下测定光密度值,查对标准曲线并计算,便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时,每断裂一个糖苷键需加入一分子水, 所以在计算多糖含量时应乘以 。实验试剂与器材 1、实验材料:面粉。 2、实验试剂(1)、 1mg/mL 葡萄糖标准液 准确称取 80 ℃烘至恒重的分析纯葡萄糖 100mg ,置于小烧杯中,加少量蒸馏水溶解后,转移到 100mL 容量瓶中,用蒸馏水定容至 100mL ,混匀, 4℃冰箱中保存备用。(2)、 3,5- 二硝基水杨酸( DNS )试剂 将 DNS 和 262mL 2M NaOH 溶液,加到 500mL 含有 185g 酒石酸钾钠的热水溶液中,再加 5g 结晶酚和 5g 亚硫酸钠,搅拌溶解,冷却后加蒸馏水定容至 1000mL , 贮于棕色瓶中备用。(3)、碘-碘化钾溶液:称取 5g 碘和 10g 碘化钾,溶于 100mL 蒸馏水中。(4)、酚酞指示剂:称取 酚酞,溶于 250mL 70% 乙醇中。(5)、 6M HCl 和 6M NaOH 各 100mL 。(二)、实验器材(1)具塞玻璃刻度试管: 20mL × 11 (2)大离心管: 50mL ×2 (3)烧杯: 100mL × 1 (4)三角瓶: 100mL ×1 (5)容量瓶: 100mL × 3 (6)刻度吸管: 1mL ×1; 2mL ×2; 10mL ×1 (7)恒温水浴锅(8)沸水浴(9)离心机( 11 )分光光度计分光光度计的基本原理是溶液中的物质在光的照射下,产生了对光吸收的效应,物质对光的吸收是具有选择性的。各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱,因此当某单色光通过溶液时,其能量就会被吸收而减弱,光能量减弱的程度和物质的浓度有一定的比例关系,也即符合比色原理—— Lambert-Beer's law: 数学表达式: A=lg(1/T)=KCL A为吸光度 T为透射率,是投射光强度比上入射光强度 C为吸光物质的浓度 L为吸收层厚度 K为吸收系数物理意义是当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的西光物质时, 其吸光度 A与吸光物质的浓度 C及吸收层厚度 L成正比.