幽门螺杆菌.ppt

1. Hp培养
有学者认为，细菌培养方法作为细菌性微生物诊断的“金标准”，Hp培养应该大力提倡。经征求意见，认为Hp培养作为经典的方法值得推荐，但过份要求Hp培养作为诊断标准可能使Hp检测变得复杂、缓慢和降低效率，应根据其特点合理应用：
（1）优点：可获得宝贵的Hp菌株；用于菌株分型、科研及临床药敏试验
（2）优点：能检出少量的Hp感染
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（3）但技术要求相对较高，多种原因可致失败：如Hp球形变、培养基不新鲜，选择性抗生素浓度不合适、培养条件不合适、杂菌或霉菌污染等
（4）需时3~5天，菌落很少时需6~9天；一次培养时间过长不易传代，且Hp发生球形变时鉴别困难
（5）不能仅根据菌落形态诊断，仍需生化及形态学鉴定：虽菌落有其特点（针尖大的隆起、湿润、透明或半透明菌落），但当杂菌受抗生素抑制时与Hp生长良好时菌落就相当接近
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（6）需胃镜检查取材或吞线等方法取材；
（7）方法：①现场用胃粘膜在平板上接种：需要新鲜培养基、微氧气体环境（烛罐法）、室温下数小时内送检；②在保菌液中低温下3天内培养或超低温数周内培养，接种时采用梯度单向双平板涂沫接种可提高检出效率，避免污染干扰
（8）特别适用：用于根治失败者药敏试验，不规则治疗后或某些胃内生境不利于Hp生长的情况：如胆汁反流性胃炎、萎缩性胃炎、胃癌患者RUT阴性时
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杂菌越来越少，Hp越来越多及更纯
活检胃粘膜低温保菌梯度单向双平板涂沫接种法
平板一
平板二
单平板培养：胃内清洁，粘膜标本水份较少
双平板培养：胃内不够清洁（如胃癌、胃潴留时），及粘膜水份过多时
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南方医院Hp培养情况：
培养环境：
器材：（原用）厌氧罐+培养箱→厌氧培养箱。
微环境：CO2约8%，O2约5%，N2约80% （平衡用），H2约5%（非必需，但与厌氧菌培养合用）。→抽气至-500mmHg, 充入无氧的混合气（10%CO2、5%H2、85%N2）；如平板少，无混合气，可点蜡烛消耗多余氧气，效果稍差
培养基：（上海）空肠弯曲菌培养基琼脂+选择性抗生素（全量与半量无差异）+冻融羊血约5%（过多并不好），~%蛋黄（Hp生长更快，更好但易球形变）
培养时间：培养3天，阴性可加2天
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接种方法：
培养基要求：新鲜，多现制现用，超过1周效果差。
现场接种：原先常用，阳性率高。需厌氧罐、培养基、接种、点蜡烛至微需氧→重新抽气换气在厌氧培养箱（杭州产）中培养
低温保菌接种--直接涂布： mL含30%甘油的布氏肉汤保菌液中，至-10~-15℃，3天内接种平板（梯度单向平板涂沫），阳性率高，组织可置-70℃保存备用。 --组织研磨涂布：较少用，易污染
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培养效果：
培养2~3天形成明显菌落
菌落数（1~数个菌落~纯培养样++++）
72小时开始出现球形变（生长过度）
部分RUT阴性者可培养出数个~数十个Hp菌落
偶有失败：气体因素、温度控制、培养基因素、标本自溶因素、标本杂菌过多、霉菌污染等
典型病例：胃窦胆汁反流性胃炎，RUT（-），培养：数个~数十个Hp样菌落，增菌鉴定）；胃体较多浅表隆起糜烂，RUT（++++），培养（++++）
应用：分离少见疾病的Hp：胃癌等,用于科研
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2. 生化检测
尿素酶：Hp具有特征性的强尿素酶活性（但不能与Hh感染鉴别），尿素酶依赖性试验主要有：
RUT：快速、准确、价廉，适合胃镜检查时用；但胆汁反流性胃炎、胃窦病变严重、萎缩等可致分布不均及Hp量少而出现假阴性
14C-UBT：快速无创，Hp分布不均对结果影响不大，有定量价值，适合疗判定；安全
13C-UBT：同上，费用较高
15N尿氨排泄试验：开展尚少
其他酶：触酶(+)、过氧化物酶(+)、马尿酸钠水解酶(-)等：用于菌株鉴定
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3. 形态学检测
Hp具有典型的螺旋形或弯曲杆状形态
(1)涂片镜检：胃粘膜涂片/印片Gram染色镜检 阳性率高，简便，可鉴别Hh感染
菌落涂片暗视野镜检 简便，可观察动力、纯度菌落涂片Gram染色镜检 可了解Gram染色特征
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(2) 组织切片染色检查：如Warthin-Starry银染色：对比度最好，阳性率最高，可检出极少量的Hp 甲苯***兰染色：简便，临床常用
改良Giemsa染色：简便，临床常用
石炭酸复红染色：对比差 Gimenez染色：对比好，较繁琐吖啶橙染色：对比好，较繁琐阿的平染色：对比好，较繁琐组织切片免疫组化染色检查：原位检查Hp形态变异者佳
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