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免疫组化实验方法ppt课件.ppt


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文档列表 文档介绍
免疫组化实验方法
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免疫组织化学的概念
利用抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质),对其进行定位、定性及定量的研究,称为免疫组织化学。
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最突出的优点
在更广阔的范围内,把结构与功能及代谢结合起来,在微观世界原位地确定组织及细胞结构的化学成分,达到方法统一,定性可靠,定位准确,定量可能。
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免疫组化实验标本
组织标本(石蜡切片和冰冻切片)
细胞标本(组织印片、细胞爬片和细胞涂片)。
石蜡切片对于组织形态保存好,且能作连续切片,有利于各种染色对照观察;还能长期存档;
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细胞和组织的固定
1.固定的作用--使细胞内蛋白质凝固、终止或抑制外源性和内源性酶活性,最大限度地保存细胞和组织的抗原性,使水溶性抗原转变为非水溶性抗原,防止抗原弥散。
2.选择最佳固定液的标准:保持组织形态结构;保存抗原性。
(1)醛类固定剂:穿透性较强,收缩性小,是常用的固定剂。如10%中***尔马林液、4%多聚甲醛缓冲液、戊二醛-甲醛液、乙酸-甲醛液等。
(2)非醛类固定剂:适用于多肽类激素的组织固定,常与戊二醛或多聚甲醛混合使用。
(3)丙酸及醇类固定剂:沉淀蛋白质和糖,保存抗原性较好。但对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质的保存效果较差,和其它试剂混合使用加以解决,如加冰乙酸、***、***仿、甲醛等。
3.常用的固定方法--浸入法和灌注法(适用于动物实验研究)
组织新鲜 勿干燥 体积适中 固定液足够(>20倍)
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抗体
常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。
特性比较:
均一性
2. 稳定性
3. 特异性
4. 重复性
5. 沉淀反应
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荧光素标记抗体
能够产生荧光并能作为染料的化合物称为荧光色素。必备条件:
③ 荧光颜色与背景组织的自发荧光颜色对比鲜明,能清晰判断结果。
④ 结合抗体蛋白后对抗体的免疫学性质和生化性质无影响,用于活体内标记,结合物应无毒,附加抗原性小。
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常用的染色方法
根据标记物的不同分为免疫荧光法,免疫酶标法,亲和组织化学法
按标记物定位于抗原所在部位的手段,则可将免疫细胞组织化学染色方法分为直接法(一步法)、间接法(二步法)、桥连法等。每进行一步结合反应。都会产生一次阳性结果的放大效应。敏感性由高到低依次为桥连法、间接法、直接法。
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染色的基本程序
①标记抗体与标本中抗原反应结合;
②用缓冲液洗去未结合的成分;
③直接观察结果;或显色后再用显微镜观察。
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反应条件
抗原抗体结合属于可逆性反应,具有共性的反应条件:
(1)PH:中性及弱硷性条件(PH 7~8)有利于免疫复合物的形成
(2)离子强度:~ M的低离于强度有利于免疫复合物的形成
(3)去污剂:有利于复合物的形成,常用的非离子型去污剂有吐温-20,EDTA(%),Triton X-100(~1%)
(4)抗体稀释液中蛋白质浓度:稀释液中含无关蛋白质可以减少抗体的非特异吸附,常用牛血清白蛋白
(5)防腐剂:微生物生长会干扰抗原抗体反应,稀释液和抗体液中加入适量的叠氮钠或硫柳***以防腐
(6)温度和时间:较高的反应温度(37℃)可加速抗原抗体结合反应,低温有利于抗原抗体结合率的提高
(7)洗涤:除去未结合抗原或抗体,除去非特异性吸附造成的背景染色。选用自来水、生理盐水或PBS等,加去污剂并在洗涤过程中加以振摇
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  • 上传人满腹经纶
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  • 时间2021-07-20