酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究.doc

.页眉. 页脚.. 酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究袁某某(西北农林科技大学陕西杨凌) [摘要]采用自溶法从酵母中提取蔗糖酶,即在一定 PH和适当的温度下,利用组织细胞内自身的酶系统将细胞破碎再通过乙醇的分级与透析,得到纯化的酵母蔗糖酶。本实验也通过考马斯亮蓝 G250 染色法,测定蔗糖酶的活力和蛋白质浓度,对蔗糖酶的性质进行了研究。[关键词]蔗糖酶,分离提取,酶活力,蛋白质含量 1 引言自 1860 年 Bertholet 从啤酒酵母( yces Cerevisiae )中发现了蔗糖酶以来,它已被广泛地进行了研究。蔗糖酶( invertase )(β-D- 呋喃果糖苷果糖水解酶)( ) 特异地催化非还原糖中的β- 呋喃果糖苷键水解,具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖,也能催化棉子糖水解,生成蜜二糖和果糖。 2 材料与方法 实验材料高活性干酵母粉、 DEAE 纤维束 DE-23 、 Tris-HCL 缓冲液、牛血清蛋白、考马斯亮蓝 G-250 、葡萄糖、水杨酸、 NaOH 溶液 实验方法 蔗糖酶的提取与部分纯化将 15g 高活性干酵母粉倒入 250ml 烧杯中, 少量多次地加入 50ml 蒸馏水, 搅拌均匀, 成糊状后加入 乙酸钠、 25ml 乙酸乙酯, 搅匀, 再于 35℃恒温水浴中搅拌 30min 。抽提补加蒸馏水 30ml ,搅匀,盖好,于 35℃恒温过夜, 8000r/min 离心 10min ,弃沉淀及脂层, 的粗级分Ⅰ。预先将恒温水浴调到 50℃,将盛有粗体级分Ⅰ的离心管稳妥地放入水浴中,不断轻摇离心管保存 30min 。取出离心管,于并于中迅速冷却, 4℃, 10000r/min, 离心 10min 。取上清液,量出体积,留出 测定酶活力及蛋白质含量(称为热级分Ⅱ)。将热级分Ⅱ转入小烧杯中,放入冰盐浴,逐滴加入等体积预冷至-20 ℃的 95% 乙醇,同时轻轻搅拌 30min ,再冰盐浴 10min ,以沉淀完全。 4℃, 10000r/min, 离心 10min ,弃去上清液, 并滴干, 沉淀保存于离心管中, 盖上盖子, 然后将其放入冰箱中冷冻保存, 即醇级分Ⅲ。 酶活性及酶活力影响因素的研究采用水杨酸试剂显色法,通过测定反应后样品中还原糖的量来确定酶活力。(1) 标准曲线的制作取做好编号的试管,按下表进行实验。管号 0123456789 10 20mmol/L 葡萄糖/ml 葡萄糖/ μ mol 02468 10 12 14 16 18 20 OH 2 /ml 水杨酸试剂/ml 22222222222 沸水浴 5min ,流水冷却,定容至 15ml 540A 0 2 1 5 2 3 3 5 2 0 9 .页眉. 页脚.. (2) 反应时间的影响取做好编号的试管,按下表进行实验。管号 123456789 10 蔗糖/ml 乙酸缓冲液 OH 2 /ml NaOH/ml 由加酶开始计时蔗糖酶/ml 反应时间/min 0136 10 15 20 30 40 50 反应时间到后立即向 2~10 管加入 1ml NaOH 终止反应。并向各管加入 2ml 3,5- 二硝基水杨酸,沸水浴准确煮 5min 后,迅速流水冷却,用水定容至 15ml 540A 6 7 4 4 3 7 2 4 9 6 生成还原糖μ mol/ml 2 3 1 9 8 50 2 3 0 (3) pH 值的影响取做好编号的试管,按下表进行实验。管号 12345678 蔗糖/ml 乙酸缓冲液 pH