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Real-Time PCR：从原理到步骤详解、再到终极数据分析
作者：解螺旋·猫大
导语小伙伴们，今天我们来解析一下 Real-Time PCR，从原理到步骤详解再到数据分析，一个都不能少！
在正式开讲之前呢，猫大必须要安利一个网址： / 。对，这就是著名的哈佛引物库！目前 PrimerBank 收录了超过 306,800 对 Real-Time PCR 引物，涵盖了大部分人类和小鼠基因。小伙伴们可以用 GenBank Accession，NCBI protein Accession，NCBI Gene ID，Gene Symbol，PrimerBank ID 或者关键词去库里搜索引物。而且还整合了blast 功能，可以拿目的基因序列去 primerbank 的数据库里进行blast。据说其中收录的 26,855 对小鼠引物经过 Real Time PCR 验证后，其中 22,187 对引物是可用的，%！！！但是猫大建议小伙伴们，在库里搜索到引物之后呢，别忘了用 oligo 6 评价一下引物，多练****一下 oligo 6 的使用也是很好的嘛。
好，下面开讲 Real-Time PCR，我们就从 Real-Time PCR 的发展史说起，包括 Real-Time PCR 的原理，实验设计，实际操作，数据分析，常见问题解答五个方面，手把手教你从各个方面了解 Real-Time PCR 。由于内容比较多，这五个部分会分成 3 讲。首先是 Real-Time PCR 的原理，实验设计和实际操作。Real-Time PCR 发展史Real-Time PCR 的技术的发展是伴随着 Real-Time PCR 仪的研制。1995
年，美国 ABI 公司（已经并入 Invitrogen 公司）成功研制了 Taqman 技术，并推出了首台荧光定量 PCR 检测系统 7700，通过检测每个循环的荧光强度对 PCR 进程进行实时检测。由于在 PCR 扩增的指数时期，模板的 Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以以 Ct 值可进行表达定量。由于 Real-Time PCR 能克服常规 PCR 的缺点，并且具有操作简便，灵敏度高，重复性好等优点，因此发展非常迅速，从而荧光定量 PCR 获得广泛应用。Real-Time PCR 实验原理实时 PCR 就是在 PCR 扩增过程中，荧光信号被收集，转化为成为扩增和熔解曲线，以实现对 PCR 进程进行实时检测。具体数据就是基线，荧光阈值和 Ct 值。
Ct 值就是荧光值达到阈值时候的 PCR 循环次数。Ct 值跟初始模板的量成反比。 第 3-15 个循环的荧光值就是基线（baseline），是由于测量的偶然误差引起的。阈值（threshold）一般是基线的标准偏差的 10 倍。实验设计对于 Real-Time PCR 而言，首先就是实验材料的处理和准备；然后是引物设计；最后是实验和数据分析（这一部分单独说明）。
1. 实验材料的处理和准备
在第一讲 RNA 抽提中已经讲过一些，还需要注意的是， 以最基本的基因表达差异分析为例，实验材料分为对照组（CON）和处理组（TRT）。组内要有复孔，要有生物重复，这样