基因克隆及蛋白表达
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研究某一目的基因功能一般策略
目的DNA获得来自三条途径:
1. genome上的特定区域或序列
2. 含有目的DNA的质粒
3. 从cDNA文库中扩增单个已知cDNA
获得目的DNA
构建含目的DNA质粒
转化细菌蛋白表达纯化
转染真核细胞蛋白定位、表达及表型变化
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第一部分 PCR
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聚合酶链反应(PCR)技术
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)***断的技术。
PCR是利用针对目的基因所设计的一对特异寡核苷酸引物,以目的基因为模板进行的DNA体外合成反应。
PCR技术具有灵敏度高,特异性强,操作简便等特点。目前已广泛应用于分子生物学的各个领域。
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一、PCR实验原理
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一、PCR实验原理
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二、PCR的反应体系
1. PCR引物
(1) primer 长度:18-30bp
引物短特异性降低
引物长影响产物生成
(2) primer 浓度:- umol/L
浓度过高错配、引物二聚体增加
浓度过低PCR效率降低
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二、PCR的反应体系
2. 缓冲液
KCl、Tris-Cl、MgCl2 ,
Mg2+:~ mM
Mg2+ : DNA聚合酶 活性 PCR产量
Mg2+ : PCR反应特异性
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二、PCR的反应体系
3. DNA聚合酶
Taq DNA聚合酶
LA DNA聚合酶
Prime STAR (Pyrobest DNA聚合酶 )
Pfu DNA聚合酶
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