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基因克隆及蛋白表达.ppt


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文档列表 文档介绍
基因克隆及蛋白表达
1
研究某一目的基因功能一般策略
目的DNA获得来自三条途径:
1.     genome上的特定区域或序列
2.       含有目的DNA的质粒
3.       从cDNA文库中扩增单个已知cDNA
获得目的DNA
构建含目的DNA质粒
转化细菌蛋白表达纯化
转染真核细胞蛋白定位、表达及表型变化
2
第一部分 PCR
3
聚合酶链反应(PCR)技术
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)***断的技术。
PCR是利用针对目的基因所设计的一对特异寡核苷酸引物,以目的基因为模板进行的DNA体外合成反应。
PCR技术具有灵敏度高,特异性强,操作简便等特点。目前已广泛应用于分子生物学的各个领域。
4
一、PCR实验原理
5
一、PCR实验原理
6
二、PCR的反应体系
1. PCR引物
(1)  primer 长度:18-30bp
引物短特异性降低
引物长影响产物生成
(2)  primer 浓度:- umol/L
浓度过高错配、引物二聚体增加
浓度过低PCR效率降低
7
二、PCR的反应体系
2. 缓冲液
  KCl、Tris-Cl、MgCl2 ,

Mg2+:~ mM
Mg2+ : DNA聚合酶 活性 PCR产量
Mg2+ : PCR反应特异性
8
二、PCR的反应体系
3. DNA聚合酶
Taq DNA聚合酶
LA DNA聚合酶  
Prime STAR (Pyrobest DNA聚合酶 )
Pfu DNA聚合酶
9
10

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  • 上传人sxlw2014
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  • 时间2021-07-29