EGCG抑制STAT3信号通路机制的的分析研究.pdf

2 Mechanism of EGCG Inhibiting STAT3 Signaling Pathway A Dissertation Submitted to the Graduate School of Henan University in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master of Medicine By Yang Wang Supervisor: Prof. Xuequn Ren Prof. Zhaohui Shi May,2013 关于学位论文独创声明和学术诚信承诺本人向河南大学提出硕士学位申请。本人郑重声明:所呈交的学位论文是本人在导师的指导下独立完成的,对所研究的课题有新的见解。据我所知,除文中特别加以说明、标注和致谢的地方外,论文中不包括其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包括其他人为获得任何教育、科研机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同事对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。在此本人郑重承诺:所呈交的学位论文不存在舞弊作伪行为,文责自负。学位申请人(学位论文作者)签名: 201 年月日关于学位论文著作权使用授权书本人经河南大学审核批准授予硕士学位。作为学位论文的作者,本人完全了解并同意河南大学有关保留、使用学位论文的要求,即河南大学有权向国家图书馆、科研信息机构、数据收集机构和本校图书馆等提供学位论文(纸质文本和电子文本)以供公众检索、查阅。本人授权河南大学出于宣扬、展览学校学术发展和进行学术交流等目的,可以采取影印、缩印、扫描和拷贝等复制手段保存、汇编学位论文(纸质文本和电子文本)。(涉及保密内容的学位论文在解密后适用本授权书) 学位获得者(学位论文作者)签名: 201 年月日学位论文指导教师签名: 201 年月日 I 摘要研究背景:茶是世界上最受欢迎的饮料之一,并且茶能在多个方面促进健康,这是两千多年以来已经众所周知的。每日饮茶可以降低胆固醇,减少心脏病发生的几率,可以提高免疫力,能有益人体皮肤等等。在人类群体中,喝茶尤其可以降低各种类型癌症的风险,包括胃癌、直肠癌、胰腺癌等。事实上,来自于EGCG的抗氧化性能和螯合金属物的功能可能有助于茶叶抵抗肿瘤的发生。EGCG在茶多酚混合物的比例占40%左右, 因此在茶的预防肿瘤效果中起着非常重要的作用。此外,有大量证据也表明, EGCG通过调节细胞内信号传导网络,具有抗癌的性质。 Stats蛋白质家族由七种蛋白构成,而Stat3就是其中之一。Stat3具有调节许多细胞和生长因子的功能。它在许多不同类型的癌症中都表现出过度激活的状态,如乳腺癌、前列腺癌、头颈部肿瘤、肺癌、结肠癌、肝癌和胰腺肿瘤、淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤等等。此外, 通过人类肿瘤异种移植小鼠成瘤的多次研究表明,抑制肿瘤细胞中 STAT3信号传导通路的异常表达将会降低肿瘤的生长繁殖、诱导细胞凋亡、抑制血管新生、增强抗肿瘤免疫调节的细胞毒性,提高动物生存力。因此,在治疗多种类型的癌症中,STAT3已被认为是一个潜在的肿瘤药物作用分子靶标。目的:探讨EGCG通过抑制STAT3信号通路对抗肿瘤细胞的分子机制. 方法:本次研究方法共分为两个部分,第一个部分:在这个研究中,我们通过表面等离子体共振结合实验(SPR)及分子模拟对接实验探寻EGCG抑制STAT3信号传导通路的机制。第二部分是通过应用EGCG干预体外培养的肿瘤细胞,①用MTT法检测肿瘤细胞的生长抑制情况,分析药物浓度和细胞增殖抑制率之间的关系;②用流式细胞仪检测不同浓度的药物对肿瘤细胞凋亡的影响;③用蛋白免疫印迹技术和基于细胞的酶联免疫吸附实验监测药物浓度的改变对肿瘤细胞表达总Stat3蛋白和磷酸化Stat3蛋白水平的影响;④用半定量PCR法研究药物对细胞STAT3信号传导通路下游基因Bcl-xl、c-myc、 VEGF、cyclinD1mRNA的表达水平的影响。结果:基于我们在对BIAcore 分子相互作用实验的研究,EGCG抑制了Stat3蛋白与磷酸化配体的结合。此外,通过分子模拟对接实验分析,我们发现EGCG分子与位于 Stat3 SH2区的两项关键的残留r-609和k-591有着紧密的相互作用。EGCG通过抑制 II STAT3信号传导通路对肿瘤细胞生物学行为的影响的实验研究发现:不同浓度的EGCG 作用于肝癌Bel-7402和QGY-7703细胞48小时后,细胞增值抑制率呈现上升趋势。浓度越大,增殖抑制率越明显,并呈浓度效应关系(P<)。②流式细胞仪检测到EGCG 干预后48小时的肝癌细胞,细胞凋亡的百分比随着药物浓度的增加而增加,并呈浓度效应关系(P<)。③蛋白免疫