超滤管使用方法和注意事项.doc

超滤管使用方法和注意事项.doc超滤管使用方法和注意事项
蛋白浓缩和换 Buffer 通常使用的超滤管，常用 Millipore 的 Amicon-Ultra-15 超滤管（MWCOIOkD也有其它型号 的、不同体积大小和 MWC超滤管可选，视 目的蛋白的分子量与浓缩前体积、 浓缩目标体积而定。 可重复使用， 使用一次就 扔掉太浪费。以下是个人总结的使用方 法和注意事项。
1、选择合适的超滤管，主要考虑MWC和浓缩体积，最常见的是Ultra-15（ 10kD）＜ 到底选择多大截留分子量比较合适呢？ 10kDa 5kDa、还是30kDa?通常应截留
分子量不应大于目的蛋白分子量的1/3，比如目的蛋白分子量为35kDa,就可以 选择1OkDa截留分子量的超滤 管。若目的蛋白分子量为1OkD左右，贝冋以用截 留分子量3kD的超滤管。认真阅读使用说明书，注意超滤膜对各种化学物质的耐 受程度有所不同，表格中有。
2、新买来的超滤是干燥的，使用前加入 MilliQ 水，水量完全过膜，冰浴或冰箱 里预冷几分钟。然后将水倒出，即可加入蛋白液，加入的多少，以不超过管顶的 白线为准。操作要轻，加入蛋白液前，超滤管需要插在冰上预冷。
3、 平衡。质量和重心二者都要达到平衡。注意转速和加速度不可太快，否贝直 接损坏超滤膜。开始离心超滤（离心机预冷至 4 度）。不同离心机的转速 rpm 换算成 g 之后，有所不同。 具体可参阅附件里的说明书。 离心机的加速度调至最 低档，减小对膜的压力。 注意，一定要等离心机达到目的转速之后， 方可离开 离 心机，否贝离心机出问题时，无法第一时间处理，后果不可预测！膜与转轴的方 向根据说明书调整（角转离心机的情况是膜与轴垂直）。在实际使用中，一般转
速 开的比说明书里的要低，这样可以延长离心管的使用寿命。
4、 当浓缩到剩下1ml时，【取50ul国产Bradford溶液，加入10ul流穿，看有
没变蓝色，以此判断超滤管是否漏掉蛋白。如果管漏了，将 上层和流穿重新倒 入新管中开始超滤。要精确判断是否漏管，用 5mg/ml的BSA离心10min,再取
流穿，跑蛋白胶或 Bradford 粗测】，继续加入 剩下的蛋白液浓缩 （在冰上操作， 防止蛋白受热） ，直到所有浓缩液都加完为止。 离心过程中注意是否发生蛋白沉 淀，导致堵管。若发生沉淀，要确定沉淀的具体原 因，是蛋白浓度过高还是 Buffer 不合适；前者可用多根超滤管同时超滤，降低浓度的办法解决，后者的 方法是换不同的 Buffer ，直到蛋白不发生沉淀为 止。
5、 前面几步用以浓缩蛋白，如果要换 Buffer，在总蛋白液浓缩至1ml左右的时 候，轻轻加入新的Buffer （），再 浓缩至1ml左右，连 续三次，最后一次的浓缩终体积根据需要的蛋白浓度而定，一般不多于 500ul， 也有浓缩至 200ul 以内的情况。 按照每次至少 10倍 左右的体积浓缩算， 三次达 到 1000 倍以上，基本上可以达到换 buffer 的目的。
6取出最