苏云金芽孢杆菌晶体杀虫蛋白cry1ac基因在虫生真菌球孢白僵菌中表达.pdf

I 摘要真菌杀虫剂具有效费比高、安全性好、能够发挥持续控制效果并且易于人工培养等优点,但存在受环境影响较大、杀虫效果慢和效果不稳定等弱点, 因而一定程度上限制了其大规模应用。为此人们一直在潜心研究虫生真菌的致病分子机制,以寻找可通过基因工程手段进行改造的基因。苏云金芽孢杆菌为革兰氏阳性菌,在菌体的稳定生长期可形成伴胞晶体蛋白(parasporal crystal protein) ,又称杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal protein , ICP) 或δ-内***,是一类对害虫毒力强、致死速度快且对害虫天敌无毒性的昆虫病原微生物,昆虫病原细菌苏云金芽孢杆菌晶体杀虫蛋白 Cry1Ac基因表达的杀虫效果非常好,但能否增强真菌的毒力尚不清楚。本研究将外源的苏云金芽孢杆菌的毒力基因 Cry1Ac分别转入重要虫生真菌球孢白僵菌的两个野生型菌株:马尾松毛虫分离株 RCEF0013, 以及玉米螟分离株 RCEF3383,以构建两个单拷贝的 Cry1Ac 超表达转基因工程菌株。本实验首先构建了含有筛选标记bar 基因和外源基因 Cry1Ac的载体 pbarGPE1- Cry1Ac,通过芽生孢子法将载体质粒转入该野生型出发株R CEF0013和 RCEF3383,在加入草***磷(100? g /ml)的 SDAY培养基上筛选获得转化子, 获得了一价转 Cry1Ac 基因的工程菌株 RCEF0013- G1和 RCEF3383- G1, 从而使该 Cry1Ac 基因在转化的菌株中得到超表达。对马尾松毛虫( Dendrolimus punctatus) 进行生物测定的结果显示,工程株 Bb13- G1对马尾松毛虫的 LC 25比出发株降低 , LD 25减少 , LT 25缩短 , 说明其对马尾松毛虫的侵染毒力明显提高;喂食处理和虫体喷雾喂食结合处理与单纯虫体喷雾处理相比,累计致死率分别提高了 %和 %,致死中时分别缩短了 。实验结果表明苏云金芽孢杆菌晶体杀虫蛋白 Cry1Ac基因在白僵菌 Bb13中成功表达其胃毒作用效果明显, 提高了球孢白僵菌的毒力。这是 Cry1Ac基因首次在虫生真菌中表达。对玉米螟( Ostrinia furnacalis)进行生物测定的结果表明,工程株 Bb1944- G1 喷雾处理组的 LC 50和 LD 50比出发菌株 Bb1944分别降低5倍和 ;在 2×10 8 孢子/ml浓度下工程株喷雾组的 LT 50比出发株缩短 ,说明其对玉米螟的侵染毒力明显提高。两个菌株的毒力测定都说明 Cry1Ac基因在转入白僵菌后得到了表达,使得工程菌对松毛虫和玉米螟的毒力明显增强。关键词:球孢白僵菌,转基因,Cry1Ac基因,载体构建,毒力,马尾松毛虫,玉米螟 II Abstract Fungal insecticides is a sort of environmental friendly environmentally safe biopesticide, with good safety to human, vertebrates and non target invertebrates, and substantial sustainable control effect, and easiness of mass production with artificial media. On the other hand, they are subjected easily to environmental factors and kill insects slowly and not steadily, which has const rained the development of the use of the fungi. Moleculer pathogenic mechanisms have been studied in order to the virulent genes which can be improved by gene engineering. Bacillus thuringiensis is gram- positive bacterium, one of kinds which can form para sporal crystal protein(insecticidal crystal protein , ICP) or δ- endotoxin in th