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一、试验原理几乎所有蛋白质电泳分析都在聚丙烯酰***凝胶上进行,而所用条件总要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并尽可能减少其相互间的聚集。最常用的方法是将强阴离子去污剂 SDS 与某一还原剂并用,并通过加热使蛋白质解离后再加样于电泳凝胶上。变性的多肽与 SDS 结合并因此而带负电荷,由于多肽结合 SDS 的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关,因此 SDS 多肽复合物在聚丙烯酰凝胶电泳中的迁移只与多肽的大小相关。在达到饱和的状态下,每克多肽约可结合 克去污剂,借助已知分子量的标准参照物,则可测算出多肽链的分子量。 SDS 聚丙烯酰***凝胶电泳大多在不连续缓冲系统中进行,其电泳槽缓冲液的 pH 值与离子强度不同于配胶缓冲液,当两电极间接通电流后,凝胶中形成移动界面, 并带动加入凝胶的样品中所含的 SDS 多肽复合物向前推进。样品通过高度多孔性的积层胶后,复合物在分离胶表面聚集成一条很薄的区带(或称积层)。曲于不连续缓冲系统具有把样品中的复合物全部浓缩于极小体积的能力,故大大提高了 SDS 聚丙烯酰***凝胶的分辨率。样品和积层胶中含 Tris-Cl() ,上下槽缓冲液含 Tris- 甘氨酸() , 分离胶中含Tris-Cl() 的。%SDS(Laemmli,1970) , 样品和积层胶中的***离干形成移动界面的先导边界而甘氨酸分子则组成尾随边界,在移动界面的两边界之间是一电导较低而电位滴度较陡的区域,它推动样品中的多肽前移并在分离胶前沿积聚,此处 pH值较高,有利于甘氨酸的离子化, 所形成的甘氨酸离子穿过堆集的多肽并紧随***离子之后,沿分离胶泳动。从移动界面中解脱后, SDS 多肽复合物成一电位和 pH值均匀的区带泳动穿过分离胶,并被筛分而依各自的大小得到分离。丙烯酰***凝胶电泳通常用来查看蛋白混合物样品的复杂程度和监测纯化效果。这种方法分离效果极好,可惜很难在不丧失精度情况下放大到制备规模,因为随着胶厚度的增加,电泳时的热效应会严重干扰蛋白的泳动。 Western bloting 首先是要将电泳后分离的蛋白从凝胶中转移到 NC膜上,通常有两种方法:毛细管印迹法和电泳印迹法。毛细管印迹法是将凝胶放在缓冲液浸湿的滤纸上,在凝胶上放一片 NC膜,再在上面放一层滤纸等吸水物质并用重物压好,缓冲液就会通过毛细作用流过凝胶。缓冲液通过凝胶时会将蛋白质带到 NC膜上, NC膜可以与蛋白质通过疏水作用产生不可逆的结合。但是这种方法转移效率低,通常只能转移凝胶中的一小部分蛋白质( 10%-20% )。而电泳印迹可以更快速有效的进行转移。这种方法是用有孔的塑料和有机玻璃板将凝胶和 NC 膜夹成“三明治”形状,而后浸入两个平行电极中间的缓冲液中进行电泳,选择适当的电泳方向就可以使蛋白质在电场力的作用下离开凝胶结合到 NC膜上。常用的电泳转移方法有湿转和半干转。两者的原理完全相同,只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同。湿转是一种传统方法,将胶/膜叠层浸入缓冲液槽然后加电压。这是一种有效方法但比较慢,需要大体积缓冲液且只能用一种缓冲液。半干转移,用浸透缓冲液的多层滤纸代替缓冲液槽。与湿转相比,这种方法要快( 15-45 分钟)。转移后的 NC膜就称为一个印迹(blot ),用于对蛋白质的进一步检测。印迹首先用蛋白溶液(如10% 的BSA 或脱脂奶粉溶液)处理以封闭 NC膜上剩余的疏水结合位点,而后用所要研究的蛋白质的抗体(一抗)处理,印迹中只有待研究的蛋白质与一抗特异结合形成抗原抗体复合物,而其它的蛋白质不能与一抗结合, 这样清洗除去未结合的一抗后,印迹中只有待研究的蛋白质的位置上结合着一抗。处理过的印迹进一步用适当标记的二抗处理,二抗是指一抗的抗体,如一抗是从鼠中获得的,则二抗就是抗鼠 IgG 的抗体。处理后,带有标记的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置,即是待研究的蛋白质的位置。目前有结合各种标记物的抗体特定 IgG 的抗体(二抗)可以直接购买,最常用的一种是酶连的二抗,印迹用酶连二抗处理后,再用适当的底物溶液处理,当酶催化底物生成有颜色的产物时,就会产生可见的区带,指示所要研究的蛋白质位置。在酶连抗体中使用的酶通常是碱性磷酸酶( AP)或辣根过氧化物酶( HRP )。碱性磷酸酶可以将无色的底物 5-溴-4- ***吲哚磷酸盐( BCIP )转化为蓝色的产物;而辣根过氧化物酶可以将 H2O2 为底物,将 3-氨基-9- 乙基咔唑氧化成褐色产物或将 4-***萘酚氧化成蓝色产物。另一种检测辣根过氧化物酶的方法是用增强化学发光法,辣根过氧化物酶在 H2O2 存在下,氧化化学发光物质鲁米诺并发光,通过将印迹放在照相底片上感光就可以检测出辣根过氧化物酶的存在,即目标蛋白质的存在了。除了使用抗