细胞计数方法------细胞计数板法.doc

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细胞计数方法 细胞计数板法
实验原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细 胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。
具体操作：
1. 将计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板。
2. 将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间，静 置3min，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。
3. 计算板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按公式计算：
细胞数/mL=四大格细胞总数/4 X104个/ml
（注：当细胞很多时，可在四个格中选一定数目较平均的小格，由于每大格中有
16个小格，然后计左侧和上方的细胞数，求出每小格的细胞数，取平均值 m，
m X16即每个格的平均值。所以，细胞密度 =m X16 X104个/ml）
说明：公式中除以4，因为计数了 4个大格的细胞数
公式中乘以10 4因为计数板中每一个大格的体积为：
（高）=
（长） X （宽） X 1ml=1000ul=1000mm
（注意：镜下偶见有两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞
团10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。）
细胞计数板的使用
一、血球计数板-基本构造
血球计数板是一块特制的厚型载玻片， 载玻片上有四个槽构成三个平台。中间的 平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各刻有一小方格网， 每个方格网共分九个大格，中央的一大格作为计数用，称为计数区。计数区的刻 度有两种：一种是计数区分为16个大方格（大方格用三线隔开），而每个大方 格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成 25个大方格（大方格之间用 双线分开），而每个大方格又分成16个小方格。但是不管计数区是哪一种构造， 它们都有一个共同特点，即计数区都由 400个小方格组成。
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计数区边长为1mm，则计数区的面积为1mm 2，每个小方格的面积为
1/400mm 2。盖上盖玻片后，计数区的高度为 ，所以每个计数区的体积 3，每个小方格的体积为1/4000mm 3。
使用细胞计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量， 再换算成每毫升 菌液（或每克样品）中微生物细胞的数量。
二、细胞计数板-使用方法
1 •视待测菌悬液浓度，加无菌水适当稀释（斜面一般稀释 100倍），以每小格
的菌数可数为度。
2 •取洁净的细胞计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。
3 •将菌悬液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片 的下边缘摘入一小滴（不宜过多），让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区，
勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。 也可以将菌悬液直接 滴加在计数区上（不要使计数区两边平台沾上菌悬液， 以免加盖盖玻片后，造成 计数区深度的升高），然后加盖盖玻片（勿使产生气泡）。
4 •静置片刻，使细胞沉降到计数板上，不再随液体漂移。将细胞计数板放置于 显微镜的载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。 由于生活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应减弱光照的强度。
5 .计数时若计数区是由 16个大方格组成；按对角线方位，数左上左下、右 上、右下的4个大方格（即100小格）的菌数。如果是25个大方格组成的计数
区，除数上述四个大方格外，还需数中央 1个大方格的菌数（即80个小格）。 为了保证计数的准确性，避免重复计数和漏记，在计数时，对沉降在格线上的细 胞的统计应有统一的规定。如菌体位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下 线，数左线不数右线，以减少误差。即位于本格上线和左线上的细胞计入本格， 本格的下线和右线上的细胞按规定计入相应的格中。 见下图：即本格中计数细胞
为3个。
6 •对于出芽的酵母菌，芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。
每个样品重复计数2-3次（每次数值不应相差过大，否则应重新操作）， 按公式
计算出每mL （g ）菌悬液所含细胞数量。
7 •测数完毕，取下盖玻片，用水将细胞计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹
擦，以免损坏网格刻度。洗净后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒内保存。
三、细胞计数板-计数公式
1、16格X25格的细胞计