医学分子生物学基因结构与表达分析方法
第一节 DNA序列分析
一、双脱氧末端终止法
二、化学降解法
三、DNA自动化序列分析
四、新一代DNA测序分析
一、双脱氧末端终止法
DNA合成反应
ATP、dATP和ddATP的结构
1. 双脱氧末端终止法原理
DNA合成反应中,ddNTP不存在3’-OH末端,故不能与下一个核苷酸的5’-P端形成3’,5’-磷酸二酯键,导致DNA新链的延伸提前终止于ddNTP.
DNA测序技术基础
高分辨率的变性聚丙烯酰***凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE)
能分离长度为300-500bp,差别仅1个碱基的单链寡核苷酸片段
7
ddCTP
ddATP
ddTTP
ddGTP
dCTP
dATP
dTTP
dGTP
A G C T
5′ T
4
7
11
G A A T G A 3′
A
C
G
C
T
8
2. DNA测序主要步骤
单链DNA模板的制备
DNA模板与测序引物退火
掺入法标记反应(如:α-35S)
延伸-终止反应
变性聚丙烯酰***凝胶电泳
放射自显影
阅读测序结果
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