实时荧光定量PCR技术.ppt

实时荧光定量PCR技术
内容概要
荧光定量PCR的基本概念
荧光定量PCR的标记方法
荧光定量PCR解析方法
SYBR法实验流程及注意事项
常规PCR与实时荧光定量PCR
常规PCR：借助电泳对扩增反应的终产物进行半定量及定性分析
实时荧光定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析
荧光定量PCR常用的三个概念
扩增曲线
荧光阈值
CT值
Cycle（循环数）
Rn（荧光强度）
Baseline
Lg－liner phase
平台期
荧光基团
荧光检测元件
扩增曲线
Cycle（循环数）
Rn（荧光强度）
Baseline
Lg－liner phase
前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline）
荧光阈值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍
手动设置：大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值；进入指数期的最初阶段
真正的信号:荧光信号超过阈值
Threshold
荧光阈值
平台期
Ct值的定义：
PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数
Cycle（循环数）
Rn（荧光强度）
Ct value
Ct值
Ct值的特点：
相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值极具重现性
Ct值的数学原理
理想的PCR反应：
Xn=X0×2n
非理想的PCR反应：
Xn=X0 (1+Ex)n
方程式两边同时取对数得:
log Xn=log [X0 (1+Ex)n]
整理方程式得:
log X0= (- log (1+Ex) )×n+ log Xn
将C(t)和达到C(t)值时终产物的量Xc(t)带入上式得：
log X0= (- log(1+Ex) ) ×C(t)+ log Xc(t)
初始浓度的对数与循环数呈线性关系
n：扩增反应的循环次数
Xn：第n次循环后的产物量
X0：初始模板量
Ex：扩增效率
Cycle number
Ck 104
Ck 102
Sample
Lg of DNA concentration
模板DNA量越多，荧光达到阈值的循环数越少，即Ct值越小。
Log模板起始浓度与Ct值呈线性关系。
Ct值与模板起始量的关系
qPCR 常用实验方法
简单
成本较低
适用于多重PCR
特异性较好
可进行SNP检测
特异性非常好
A
B
C