实验三：药敏.ppt

实验三药敏实验内容?一、纸片扩散法( K-B 法) ?二、稀释法 (MIC) 实验目的?一、掌握纸片扩散法的原理、操作方法、结果的判断及其临床意义。?二、掌握纸片扩散法的质量控制(采用标准菌株控制可变因素)。?三、掌握肉汤稀释法抗生素敏感性试验的原理、操作方法、结果判断及临床意义。?四、了解稀释法的质量控制(采用标准菌株控制可变因素)。纸片扩散法( K-B 法) ?器材与试剂菌种:金黄色葡萄球菌 25923 和金黄色葡萄球菌临床种的 6小时肉汤培养物,调整浓度至 麦氏比浊管(相当于 × 10 8 CFU/ml) ;或挑新鲜培养的单个菌落, 在无菌生理盐水中研磨,校正其浓度至 麦氏比浊管。培养基:水解酪蛋白培养基( MH 琼脂)。其他:无菌棉签、抗菌纸片、镊子、直尺等。?原理:含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上, 纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解,不断向纸片周围区域扩散,形成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌生长被抑制,形成透明的抑菌圈。抑菌圈大小反映测试菌对测定药物的敏感程度。?方法:(4人一组, 2人做金葡菌标准种, 2人做临床种,每种菌选 4个不同的药物纸片) 1 、制备 MH 琼脂平板:将加热融化的琼脂冷却至 60 ℃左右时倾注于直径为 9cm 的无菌平板中,使琼脂厚度为 4mm ,待琼脂凝固后使用,如有冷凝水产生, 可放置 37 ℃温箱中 15-30 分钟后使用。 2 、无菌棉签蘸取菌液,在试管内壁旋转挤去多余菌液后在平板表面均匀涂布接种 3次,每次旋转平板 60 °, 最后沿平板內缘涂布 1周。 3 、平板在室温下干燥 5分钟,用无菌镊子将抗菌药物纸片贴于琼脂表面,各纸片中心相距大于 24mm ,距平板內缘大于 15mm , 37 ℃温箱中孵育 16-18 小时, 量取抑菌圈直径。?结果观察中的注意事项: 1 、准确量取抑菌圈直径,若抑菌圈为椭圆形, 量其最长径和最短径,取其平均值。 2 、若出现双层抑菌圈,一般药物测量内圈, 而磺***类药物则量其外圈。 3 、若抑菌圈内有散在菌落出现,排除污染菌的存在和其他影响因素,若无污染菌等,需重做。?结果观察: 1、结果解释:用毫米尺量取抑菌圈直径,参照书上的标准判读结果。按敏感( S)、中介( I)、耐药( R)报告。例如:抗菌药物丁***卡那霉素( AMK ),每张纸片含药量 30 微克,抑菌圈≤ 14mm 为耐药, 15-16mm 为中介, ≥ 17mm 为敏感。 2、质量控制:标准菌株的抑菌圈应落在书上的预期范围内,如果超出该范围,应为失控,而不发报告,应及时查找原因,予以纠正。例如:抗菌药物丁***卡那霉素( AMK ),每张纸片含药量 30 微克,金黄色葡萄球菌 标准株的抑菌圈应在 20-26mm 之间。?思考题: 影响因素? 1 、培养基的质量:双层抑菌圈的出现? 2 、纸片质量 3 、接种细菌的菌量 4 、孵育的温度和时间 5 、操作因素稀释法?微量稀释法?常量稀释法(试管稀释法)