还原糖和总糖的测定3,5-二硝基水杨酸比色法.doc

还原糖和总糖的测定 3,5- 二硝基水杨酸比色法一、目的掌握还原糖和总糖测定的基本原理,学****比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。二、原理还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或***基的糖类, 单糖都是还原糖, 双糖和多糖不一定是还原糖, 其中乳糖和麦芽糖是还原糖, 蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶解度不同, 可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来, 对没有还原性的双糖和多糖, 可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定, 再分别求出样品中还原糖和总糖的含量(还原糖以葡萄糖含量计)。还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物, 3,5- 二硝基水杨酸则被还原为棕红色的 3- 氨基-5- 硝基水杨酸。在一定范围内,还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系, 利用分光光度计,在 540nm 波长下测定光密度值, 查对标准曲线并计算, 便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时, 每断裂一个糖苷键需加入一分子水, 所以在计算多糖含量时应乘以 。三、实验材料、主要仪器和试剂 1. 实验材料小麦面粉;精密 pH 试纸。 2. 主要仪器(1 )具塞玻璃刻度试管: 20mL × 11 (2 )大离心管: 50mL ×2 (3 )烧杯: 100mL ×1(4 )三角瓶: 100mL ×1 (5 )容量瓶: 100mL ×3 (6 )刻度吸管: 1mL ×1; 2mL ×2; 10mL ×1 (7 )恒温水浴锅(8 )沸水浴(9 )离心机( 10 )扭力天平( 11 )分光光度计 3. 试剂(1) 1mg/mL 葡萄糖标准液准确称取 80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖 100mg , 置于小烧杯中, 加少量蒸馏水溶解后, 转移到 100mL 容量瓶中,用蒸馏水定容至 100mL ,混匀, 4℃冰箱中保存备用。(2) 3,5- 二硝基水杨酸( DNS )试剂将 和 262mL 2M NaOH 溶液,加到 500mL 含有 185g 酒石酸钾钠的热水溶液中,再加 5g 结晶酚和 5g 亚硫酸钠,搅拌溶解,冷却后加蒸馏水定容至 1000mL ,贮于棕色瓶中备用。(3 )碘- 碘化钾溶液:称取 5g 碘和 10g 碘化钾,溶于 100mL 蒸馏水中。(4 )酚酞指示剂:称取 酚酞,溶于 250mL70% 乙醇中。(5) 6M HCl 和 6M NaOH 各 100mL 。四、操作步骤 1. 制作葡萄糖标准曲线取7支 20mL 具塞刻度试管编号,按表 1 分别加入浓度为 1mg/mL 的葡萄糖标准液、蒸馏水和 3,5- 二硝基水杨酸( DNS )试剂,配成不同葡萄糖含量的反应液。表1 葡萄糖标准曲线制作 2. 样品中还原糖和总糖的测定(1 )还原糖的提取准确称取 食用面粉, 放入 100mL 烧杯中, 先用少量蒸馏水调成糊状, 然后加入 50mL 蒸馏水, 搅匀, 置于 50℃恒温水浴中保温 20min , 使还原糖浸出。将浸出液( 含沉淀) 转移到 50mL 离心管中,于 4000r/min 下离心 5min, 沉淀可用 20mL 蒸馏水洗一次,再离心,将二次离心的上清液收集在 100mL 容量瓶中, 用蒸馏水定容至刻度, 混匀, 作为还原糖待测液。(2 )总糖的水解和提取准确称取 食用面粉,放入 100mL 三角瓶中,加 15mL 蒸馏水及 10mL 6M HCl ,置沸水浴中加热水解 30min (水解是否完全可用碘- 碘化钾溶液检查)。待三角瓶中的水解液冷却后, 加入 1 滴酚酞指示剂,用 6mol/LNaOH 中和至微红色, 用蒸馏水定容在 100mL 容量瓶中, 混匀。将定容后的水解液过滤,取滤液 10mL ,移入另一 100mL 容量瓶中定容,混匀,作为总糖待测液。(3 )显色和比色取4支 20mL 具塞刻度试管, 编号, 按表 2 所示分别加入待测液和显色剂, 空白调零可使用制作标准曲线的 0 号管。加热、定容和比色等其余操作与制作标准曲线相同。五、结果与计算: 计算出 7、8 号管光密度值的平均值和 9、 10 管光密度值的平均值,在标准曲线上分别查出相应的还原糖毫克数,按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量。欢迎, 客人|免费注册|会员登录|忘记密码? 上网做生意,首选 VIP 会员|设为首页|加入桌面|收藏本页|手机版|无图版| RSS 订阅人才求购供应公司?首页?食品资讯?政策法规?生产技术?质量管理?检验技术?仪器设备?食品标准?资料中心?翻译中心?培训中心?商务中心?食品人才?食品安全?食品课堂?食品专题?食品网刊?食品网址?数据库?知识堂?会展中心?考试中心?食品家园?食品论坛糖的测定方法核心提示:对于糖的测定方法有很多,