实验十植物细胞骨架光学显微观察重点剖析.ppt

十、植物细胞骨架光学显微观察内蒙古大学生技基地一、实验目的观察光学显微镜下细胞骨架的结构, 了解显示植物细胞骨架的方法及其原理。二、实验原理细胞骨架是指在细胞中支持和连接细胞各组分,以及与细胞运动有关的结构,它包括微管、中间纤维、微丝。当用适当浓度的 Triton X- 100 处理时,可将细胞内大部分蛋白质抽提掉,但细胞骨架系统的蛋白质却仍被保存,经过固定和考马斯亮蓝 R250 染色,从而在光镜下观察到细胞骨架的网状结构。(一)器材:显微镜、 50ml 烧杯、滴管、容量瓶、载玻片、盖玻片、镊子。 (二)试剂: 1 .M一缓冲液作用: M缓冲液使细胞骨架中的微丝保持稳定。在 M缓冲液中,其中咪唑是缓冲剂 EGTA 和 EDTA 螯合 Ca 离子,溶液并提供 Mg 离子,在低钙条件下,骨架纤维保持聚合状态并且较为舒张,便于观察。配方: 50mmol /L咪唑, 50mmol / L kCl :, mmol / LMgCl2 , lmmol / L EGTA( 乙二醇双(a- 氨基乙酸)醚四乙酸), 0. 1mmoL / L EDTA , lmmol /L巯基乙醇或 DTT( 二硫苏糖醇)。三、实验用品 2. 6mmol / L PH6 .8磷酸缓冲液。 3 .1% Triton X-100 ,用 M- 缓冲液配。 4 . %考马斯亮蓝 R250 ,其溶液是甲醇 ,冰乙酸 7ml ,蒸馏水 。 5 .3%戊二醛,用 6mmol /L磷酸缓冲液(PH6 . 8)配制。 6 .5%、 7%、 95 %乙醇。 7 .叔丁醇、正丁醇、二甲苯、树胶。 (三)材料:洋葱鳞茎。磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液优缺点: ?磷酸缓冲液的优点:( 1)易配制各种浓度的缓冲液;( 2)适用的 pH 值范围宽,可配置各种 pH 值的缓冲液;( 3) pH 受温度影响较小;( 4)缓冲能力强,缓冲液被稀释后 pH 变化小。?磷酸缓冲液的缺点:( 1)易与常见的钙离子 Ca2+ 、 Mg2+ 及一些重金属离子缔合形成沉淀;( 2)会抑制某些生化反应过程,如抑制某些酶的催化过程等。考马斯亮蓝 R-250 考马斯亮蓝 R-250 是通过范德瓦尔键与蛋白质结合,尤其适用于 SDS 电泳微量蛋白质染色。它与不同蛋白质结合呈现出基本相同的颜色,并且在比较宽的范围内( 15 — 20 g ),扫描峰的面积与蛋白量呈线性关系。用考马斯亮蓝 R- 25 0后电泳图考马斯亮蓝R-250(固体) (一)取洋葱鳞茎内表皮细胞(约 lcm2 大小)若干片温于装有 PH6 .8磷酸缓冲液的 50ml 烧杯中,使其下沉。 (二)吸去磷酸缓冲液,用 1% Triton X-100 处理 20-30 分钟。 (三)吸去 Triton X-100 ,用 M- 缓冲液洗 3 次,,每次 10 分钟。. (四)3%戊二醛固定 -1 小时(对照组开始处理)。 (五) 磷酸缓冲液洗 3次,每次 10 分钟。四、实验方法(六)用 %考马斯亮蓝 R250 染色 20-30 分钟。 (七)用蒸馏水洗 1-2 次,材料置于载玻片上, 加盖玻片,即可镜检。 (八)如作永久制片,可使样品顺序通过如下试剂: 50 %乙醇, 70 %乙醇, 95 % 乙醇, 95 %乙醇和叔丁醇混合液(1: 1),每次 5-10 分钟,或正丁醇→正丁醇→二甲苯→二甲苯,每次 5-10 分钟。然后捞取样品, 平展于载玻片上,中性树胶封固。