生物课件】3，5－二硝基水杨酸比色法测定还原糖和总糖.ppt

3，5－二硝基水杨酸比色法测定复原糖和总糖
一、目的
掌握复原糖和总糖测定的根本原理，学****比色法测定复原糖的操作方法和分光光度计的使用。
二、原理
1)复原糖的测定是糖定量测定的根本方法。复原糖是指含有自由醛基或***基的糖类，单糖都是复原糖，双糖和多糖不一定是复原糖，其中乳糖和麦芽糖是复原糖，蔗糖和淀粉是非复原糖。利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有复原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有复原性的单糖进行测定，再分别求出样品中复原糖和总糖的含量〔复原糖以葡萄糖含量计〕。
2)复原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸那么被复原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，复原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在520nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中复原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需参加一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以。
三、 试剂
1〕1mg/mL葡萄糖标准液　　准确称取80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，混匀，4℃冰箱中保存备用。
2〕3,5-二硝基水杨酸〔DNS〕试剂
　　　将g DNS和262mL 2M NaOH溶液，加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中备用。
四、操作方法：〔一〕葡萄糖标准曲线的制定１〕取九支试管，分别按下表参加试剂
项目
0
1
2
3
4
5
6
7
8
葡萄糖标准液(mL)
0








相当于葡萄糖量（mg）
0








蒸馏水（mL）









3，5-二消基水杨酸试剂（mL）









２〕将各管溶液混匀，在沸水中加热5分钟，取出后立即用冷水冷却至室温，再向每管参加mL蒸馏水，摇匀。
３〕于520nm波长处测A值。以葡萄糖mg数为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。
〔二〕样品中总糖和复原糖含量的测定
１〕样品中复原糖的提取：准确称取2g山芋粉，放在100mL烧杯中，先以少量水调成糊状，然后加50－60mL蒸馏水，于50℃恒温水浴中保温20分钟，过滤，将滤液收集在100mL容量瓶中，再定容至100mL。
２〕样品中总糖的水解及提取：准确称取1g山芋粉，放在锥形瓶中，加10mL6mol/L盐酸，15mL水，在沸水浴中加热半小时，取出一、二滴置于白瓷板上，加1滴碘-碘化钾溶液检查水解是否完全。如已水解完全，那么不呈蓝色。冷却后参加1滴酚酞指示剂，以10%氢氧化钠溶液中和至溶液呈微红色，过滤并定容到100mL。再精确吸取上述溶液10mL于100mL容量瓶中，定容至刻度，混匀备用。
３〕样品中糖含量的测定：取7支试管分别按下表参加试剂：
项目
空白
还原糖
总糖
0
1
2
3
4
5
6
样品溶液(mL)
0






蒸馏水(mL)
2






3，5-二消基水杨酸(mL)







加完试剂后，其余操作与制作标准曲线时相同。