实验设计方案.doc

筛选和鉴定转化子一、实验材料: 1、实验八准备的转化产物( pMD19 T vector 和 PCR 产物,分子量分别为 2692bp 、 333bp ) 2、实验设备: PCR 仪, 恒温摇床, 台式高速离心机, 恒温水浴箱, 琼脂糖凝胶电泳装置,电热恒温培养箱,电泳仪,超净工作台。 3、实验材料:漩涡混合器,小镊子,微量移液取样器,移液器吸头, 微量离心管,双面离心管架,干式恒温气浴(或恒温水浴锅) ,制冰机,恒温摇床,超净工作台,酒精灯,无菌牙签,摇床管。 4、实验试剂 LB 培养基(加抗生素)。 PCR 用试剂、引物,质粒提取用试剂,酶切需要的限制性内切酶及其缓冲液, 65% 甘油( 65% 甘油, , Tris Cl ) .X-gal 储液( 20mg/ml ), IPTG 储液( 200mg/ml ) 5、实验准备无菌 dd water , 离心管装入铝制饭盒( 灭菌)、移液器吸头装入相应的吸头盒(灭菌) ;牙签(灭菌) ,摇菌管(灭菌), 100mg/ml 氨苄青霉素。二、实验步骤 1、转化子筛选 1) 每组连接反应转化原液取 100ul 用无菌玻璃棒均匀涂布于筛选培养基上 37℃下培养半小时以上,直至液体被完全吸收。 2) 倒置平板于 37℃继续培养 12-16 小时,平板上所长出的单菌落即为转化子。因为不带 pMDT-18 的细胞, 由于无 Amp 抗性, 不能在含有 Amp 的筛选培养基上成活。 2、重组子筛选将上述平板放于 4℃数小时,使直完全显色。带有 pMDT-18 的转化子由于具有β- 半乳糖苷酶活性,在 X-gal 和 IPTG 培养基上为蓝色菌落。带有重组质粒转化子由于丧失了β- 半乳糖苷酶活性,在加有 X-gal 和 IPTG 培养基上为白色菌落,即重组子。 3、重组质粒大小鉴定快速 PCR 筛选法(1) 在转化的平板培养基上随机选取 5-10 个边缘清晰的包色菌落, 并用记号笔在其所在的培养皿底部玻璃背面画圈做标记编号。(2)在 微量离心管中配制 25ul 反应体系。 dd water 16ul 10× PCR buffer (不含 MgCl 2) 25mM MgCl 2 dNTP 2ul( 每种 dNTP 终浓度 ) 10umol/L Primer1 1ul ( — 25pmoles ) 10umol/L Primer2 1ul ( — 25pmoles ) 模板质粒用小 tip 头轻轻粘一下选中的白色菌落,再伸入 PCR 混合液中洗一洗 Tap 酶 总体积 25ul (3) 根据厂商的操作手册设置 PCR 仪的循环程序(本实验室已经设置为 WZ ): 1、 94℃ 5min 2、 94℃ 1min 3、 60℃ 1min 4、 72℃ 1min50s 5、G oto2 29times 6、 72℃ 10min (4) PCR 结束后,取 10u l 产物进行琼脂糖凝胶电泳( 与原始插入片段同时比对), 观察胶上是否有预计的主要产物带。(5) 按照编号找到培养皿中的原菌斑。根据需要进行放大培养提取质粒。(6) 提取到得质粒与原先的