实验一-3-5-二硝基水杨酸比色法-还原糖和总糖的测定.doc

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精选
实验一还原糖和总糖的测定一一3,5-二硝基水杨酸比色法
一、实验目的
掌握还原糖和总糖测定的基本原理，学****比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。
、实验原理
还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或***基的糖类，单糖都是还 原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖 的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖， 可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量(还原 糖以葡萄糖含量计)。
还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物， 3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的
o2n
OH
氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光 度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。 由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以 。
加热
■+ 还虹抽 >
碱牲
三、实验材料、主要仪器和试剂
1. 实验材料
小麦面粉；广范 pH试纸。
2. 主要仪器
(1) 大试管：2 X 20cm X 14
(2) 烧杯：100mL X 3
(3) 三角瓶：100mL X 1
(4) 容量瓶：100mL X 3
(5) 移液管：1mL X 3; 2mL X 2; 10mL X 4
(6) 吸耳球、玻璃棒
(7) 恒温水浴锅
(8) 漏斗、滤纸
(9) 白瓷缸、电炉
(10) 精度天平
(11) 分光光度计
3. 试剂(已制备)
(1) 1mg/mL葡萄糖标准液
准确称取90C烘至恒重的分析纯葡萄糖 100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到
100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至 100mL，混匀，4C冰箱中保存备用。
(2) 3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂
3,5-二硝基水杨酸(DNS )和2mol\L NaOH 溶液262mL，加到500mL含有185g酒石酸 钾钠的热水溶液中， 再加5g重蒸酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至 1000mL,贮 于棕色瓶中，7-10天后才能使用。
(3) 6mol/L HCl 和 6mol/L NaOH 。
四、操作步骤
1. 制作葡萄糖标准曲线
取7支2X 20cm大试管编号，按表1分别加入浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液、蒸馏水和 3,5-
二硝基水杨酸(DNS )试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。
表1葡萄糖标准曲线制作
管号
葡萄糖含量
(mg)
1mg/mL葡萄糖标准液 (mL)
蒸馏水
(mL)
DNS
(mL)
吸光度值
(A 540)
0
0
0
2

1




2




3