基因敲除新技术.ppt

ZFN 技术原理锌指核酸酶( Zinc-finger nucleases, ZFN )是人工改造的限制性核酸内切酶,利用不同的锌指结构识别特异 DNA 序列,利用核酸酶切断靶 DNA 。?锌指结构中每一个α螺旋可以特异识别 3-4 个碱基; ?人工设计识别特异 DNA 序列的α螺旋采用如上的通用序列,通过改变其中 7 个X来实现识别不同的三联体碱基, TGEK 是多个螺旋间的连接序列; ?构建成对人工锌指结构域和 FokI 融合蛋白( ZFN )可以在指定区域切断 DNA 双链。 ZFN 技术锌指核酸酶介导的定向染色体删除研究人员可以利用 ZFN 技术进行各种基因编辑,比如基因敲除。已建立有 ZFN 库,识别多种 DNA 序列,但还不能达到识别任意靶 DNA 的目的,其应用受到一定的限制。崭新的技术- TALEN 经典的挑战–染色体 DNA 序列的人工编辑修改?(点)突变: Silent ; Missense ; Nonsense ; Frame shift (基因敲除, Knockout ) ?片段删除?片段插入目的与用途:生物模型;表达工具;基因治疗崭新的技术解决经典的挑战靶向基因技术?经典方法: ?***质粒,同源重组–几率低(~1 HR event per 10 6 cells ),难! ?饱含希望与失望的技术: ? ZFN ,被 Sigma 公司垄断?新的里程碑: ? TALEN TALEN 技术基于 TALEN (transcription activator-like (TAL) effector nucleases) 的靶向基因敲除技术是一种崭新的分子生物学工具,现已应用于细胞、酵母、斑马鱼与大鼠等各类研究对象。技术原理: 表达一个重组核酸酶,在靶点识别结构域的作用下,核酸酶识别靶点核酸序列,并发挥内切酶活性,从而打断目标基因,完成基因敲除的过程。? 1989 年植物病原体黄单胞菌属( Xanthomonas spp. ) avrBs3 基因被克隆。? 2007 年发现其序列特异性核酸结合特性, avrBs3 – TA ? 2009 年 Xanthomonas TA 氨基酸序列与核酸靶序列的对应关系被破译?由 34个 aa组成一个单元模块,重复 17 -18 次? 34个 aa中的第 12和 13个氨基酸( Repeat Variant Di-residue, RVD) 对应识别一个目标碱基 TALEN 发展过程人工构建 TALE 模块识别指定核酸序列 102 碱基模块单元…… 14 – 18 个重复真核表达…… 14 – 18 个重复特异识别指定的 14 -18 个核酸序列并与之结合 34 氨基酸单元 TALEN 发展过程